紧密连接蛋白claudin—3、claudin—7在鼻咽癌中的表达及意义

陈茹　苏小青　潘升华　陈了之　周静　黄益灯

[摘要] 目的 探討紧密连接蛋白claudin-3、claudin-7在鼻咽癌患者组织中的表达及临床意义。 方法 收集2014年1月～2016年1月温州医科大学附属第三医院病理科鼻咽癌患者存档蜡块标本52例作为研究对象，同时选择鼻咽黏膜正常组织20例作为对照。使用免疫组学方法检测不同鼻咽癌组织中紧密连接蛋白claudin-3、claudin-7表达情况，分析其与患者临床病理参数的关系，分析鼻咽癌组织中紧密连接蛋白claudin-3、claudin-7表达程度的相关性。 结果 鼻咽癌组织中紧密连接蛋白claudin-3阳性表达率（51.92%）与正常鼻咽黏膜组织（45.00%）比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。而鼻咽癌组织中紧密连接蛋白claudin-7阳性表达率（26.92%）与正常鼻咽黏膜组织（55.00%）比较，差异有统计学意义（P = 0.025）。claudin-3的阳性表达率在鼻咽癌Ⅲ+Ⅳ期患者中明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者（P = 0.002）。与紧密连接蛋白claudin-7在不伴淋巴结转移的鼻咽癌组织中的表达（9/15）比较，伴有淋巴结转移的鼻咽癌组织中的阳性表达（5/37）明显降低（P = 0.001）。相关性分析结果显示，紧密连接蛋白claudin-3和claudin-7无明显相关性（r = 0.2696，P = 0.0532）。 结论 claudin-3与肿瘤TNM分期有关，考虑其在鼻咽癌的发展中可能起一定的作用。claudin-7表达下调可能在鼻咽癌的发生、转移中发挥一定的作用，紧密连接蛋白claudin-3和claudin-7有望成为治疗鼻咽癌的新靶点。

[关键词] claudin-3；claudin-7；鼻咽癌；VCA-IgA；免疫组化

[中图分类号] R739 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（b）-0101-05

[Abstract] Objective To explore the expression of claudin-3， claudin-7 in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC） and to analyze the relationship between the proteins and clinical significance. Methods Fifty-two archival paraffin embedded tissue specimens of nasopharyngeal were retrospectively analyzed from January 2014 to January 2016 at the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. Another 20 samples of Histologically normal nasopharyngeal tissues were also obtained as control group. Immunohistochemstry was used to detect the expression of claudin-3 and claudin-7 in the different tissues， and the relationship was analyzed between the expression and clinic pathological parameter. The relationship of the expression levels of claudin-3 and claudin-7 in nasopharyngeal carcinoma tissues was analyzed. Results There was no statistically significant difference in the positive expression rate of claudin-3 （51.92%） between nasopharyngeal carcinoma and adjacent non-neoplastic tissues （45.00%） （P > 0.05）. While the positive expression rate of claudin-7 in nasopharyngeal carcinomas （26.92%）， in comparison with the adjacent non-neoplastic tissues （55.00%）， there was significant difference （P = 0.025）. The positive expression rate of claudin-3 in the Ⅲ+Ⅳ stage patients was significantly higher than that in the Ⅰ+Ⅱ stage patients （P = 0.002）. Compared with the positive expression rate of claudin-7 in nasopharyngeal carcinomas without cervical lymph node metastasis （9/15）， the positive expression rate in nasopharyngeal carcinomas with cervical lymph node metastasis was remarkably lower （5/37） （P = 0.001）. Correlation analysis results showed that there was no relationship between expression of claudin-3 and claudin-7 （r = 0.2696， P = 0.0532）. Conclusion claudin-3 relates to the TNM tumor staging， in consideration of the effect in the nasopharyngeal carcinoma progress. claudin-7 decreased expression plays a role in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma. claudin-3 and claudin-7 may be novel biomarkers for the new target for nasopharyngeal carcinoma treatment.

[Key words] claudin-3； claudin-7； Nasopharyngeal carcinoma； VCA-IgA； Immunohistochemistry

鼻咽癌的发生发展是一个多基因参与、多阶段变异累积形成的病理过程。寻找鼻咽癌的分子标志物将有利于鼻咽癌患者个体化治疗方案的选择及预后的评估。紧密连接蛋白是紧密连接的骨架蛋白[1]，参与紧密连接的形成及细胞间的信号转导。目前已有较多研究报告紧密连接蛋白claudin-3、claudin-7在肺腺癌等恶性肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色，参与构成恶性肿瘤发生发展过程中复杂的调控网路[2]，而claudin-3、claudin-7在鼻咽癌中的研究甚少，深入研究claudin-3、claudin-7与鼻咽癌的相关性，可能成为生物分子治疗新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月～2016年1月温州医科大学附属第三医院病理科临床资料完整、病理诊断明确的鼻咽癌存档蜡块标本52例作为实验对象，其中男40例，女12例；年龄11～85岁（中位年龄44.6岁）。收集全部病例的血清VCA-IgA阳性情况，根据抗体滴度分为+（低滴度，1∶5～1∶20），++（中滴度，1∶40～1∶80），+++（高滴度，>1∶160），其中阴性6例，低滴度13例，中滴度23例，高滴度10例。按WHO国际组织分类标准，组织病理类型包括未角化性癌46例，角化鳞状细胞癌6例；按2010年国际抗癌联盟UICC/AJCC TNM临床分期：Ⅰ+Ⅱ期病例32例，Ⅲ+Ⅳ病例20例；颈部淋巴转移病例37例，无淋巴结转移病例15例。同时另选取癌旁鼻咽黏膜正常组织20例作为对照。所有病例均为初发病例，均未接受手术、放化疗等治疗。

1.2 主要试剂和检测方法

抗人claudin-7抗体及其免疫组化试剂盒（美国abcam公司），抗人claudin-3抗体及其免疫组化试剂盒（上海长岛生物技术有限公司）。采用SP法免疫组化染色，操作步骤按说明书进行，用PBS液代替一抗作为每次染色的阴性对照。在显微镜下观察，以细胞膜和＼或细胞质中出现黄棕色着色颗粒或团块为细胞中claudin-3、claudin-7阳性。根据细胞染色强度计分：无染色为0分；有染色中淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每张切片随机观察10个高倍视野，计数阳性细胞，根据阳性细胞所占比例不同分为4级：阳性细胞比例≤10%为0分，>10%～50%为1分，>50%～75%为2分，>75%～100%为3分。总的免疫染色评分=免疫染色强度计分×阳性细胞比例分级计分。根据各指标的免疫染色评分将结果分为：阴性（-）为0分，弱阳性（+）为1～2分，阳性（++）为3～4分，强阳性（+++）为5～9分。阳性表达率=（弱阳性例数+阳性例数+强阳性例数）/总例数×100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件对所得数据进行统计分析，比较claudin-3和claudin-7在鼻咽癌组织及癌旁正常组织中的阳性表达率，采用Fisher确切概率法（当T<1或n<40）或使用χ2检验校正公式（当140）进行统计分析。采用χ2检验分析claudin-3和claudin-7与各临床病理学因素之间的关系。用重复方差分析进行claudin-3和claudin-7在血清VCA-IgA各滴度间两两比较。用Spearman相关分析分析claudin-3与claudin-7表达程度相关性。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紧密连接蛋白claudin-3、claudin-7在不同组织中的表达

claudin-3、claudin-7在鼻咽癌及癌旁正常组织中的细胞膜和＼或胞浆呈黄褐色颗粒（图1～2，封三）。claudin-3在癌旁正常组织中阳性表达率为45.00%，而在鼻咽癌中的表达率为51.92%。二者比较，差异无统计学意义（P = 0.599）。claudin-7在癌旁正常组织中阳性表达率为55.00%，而在鼻咽癌中的表达率为26.92%，其在鼻咽癌中的表达明显较癌旁正常组织低，差异有统计学意义（P = 0.025）。见表1。

2.2 鼻咽癌组织中紧密连接蛋白claudin-3和claudin-7表达与临床病理参数之间的关系

不同性别、年龄、颈部淋巴结转移、血清VCA-IgA阳性率、病理分型患者的claudin-3表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；但不同TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期患者claudin-3阳性表达率为34.38%，低于在Ⅲ+Ⅳ期患者（80.00%），差异有统计学意义（P = 0.002）。不同性别、年龄、血清VCA-IgA阳性率、病理分型及TMN分期患者claudin-7阳性表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05），claudin-7在伴有颈部淋巴结转移鼻咽癌组织中的阳性表达率为13.51%，低于不伴有颈部淋巴结转移鼻咽癌組织（60.00%），差异有高度统计学意义（P = 0.001）。见表2。

2.3 鼻咽癌组织中claudin-3和claudin-7在不同滴度血清VCA-IgA患者中的表达

血清VCA-IgA阴性的claudin-3阳性表达率为16.67%（1/6），低于血清VCA-IgA高滴度患者[70.00%（7/10）]，差异有统计学意义（P = 0.028）。claudin-7阳性表达率在血清VCA-IgA阴性、低滴度、中滴度、高滴度中的阳性表达率（0.00%、38.46%、34.78%、10.00%）两两比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。

2.4 鼻咽癌组织中claudin-3和claudin-7表达的相关性分析

Spearman相关分析结果提示，鼻咽癌组织中claudin-3和claudin-7表达无明显相关性（r = 0.2696，P > 0.05）。见表3。

3 讨论

鼻咽癌是我国头颈部最高发的恶性肿瘤，有研究[3-4]显示，早期鼻咽癌患者经过正规放化疗治疗后，治愈率可达到90%，而其中有30%～40%的患者仍会出现远处转移和局部复发，从而导致鼻咽癌的治疗失败。而Li等[5]研究发现在初诊时就已伴有转移的鼻咽癌患者占60%，其中以颈部淋巴结转移为主，比例达到79.8%。肿瘤的侵袭转移是从离开原发组织的癌细胞扩散侵犯至邻近周围组织结构开始；并通过其入侵的血管或淋巴管，继续到达远处组织；在停留的部位重新形成新的转移瘤[6]。因此，探索鼻咽癌的转移机制和寻找能提示鼻咽癌转移的分子标志物一直是各个实验室研究的热点。

近年研究表明claudins不仅维持上皮细胞和内皮细胞的栅栏功能、屏障功能[7]，并有研究显示在恶性肿瘤发展的一系列病理生理过程中发挥一定作用[8]。claudins在不同的肿瘤组织中呈现不同的表达，发挥不一样的作用，claudin-3也是如此。Soini[9]通过免疫组化检测发现claudin-3在肾癌、膀胱癌组织中表达下调，而淋巴瘤中不表达。考虑与发生肿瘤时，紧密连接结构破坏，细胞间黏附性降低或丢失，失去限制肿瘤细胞的营养和相关生长因子供应的作用，而使肿瘤细胞缺乏分化，侵袭力增强等情况相符。Kominsky等[10]研究显示claudin-3在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌组织中的表达较正常组织升高；又有学者研究发现，claudin-3在结直肠癌中表达亦上调，并表示表达越强，预后可能越差，提出claudin-3可能成为判断结直肠癌预后的标志物[11]。在肿瘤发生、发展及浸润转移过程中均可出现claudins蛋白的表达降低或缺失，可能跟肿瘤细胞间黏附功能的破坏、异型性增大及侵袭力增加等方面有关[12]。有学者研究发现，WNK4激酶能够使claudin-3蛋白磷酸化，指出细胞间紧密连接蛋白的正常功能可能因claudin-3蛋白的磷酸化而遭到破坏[13]。有研究发现小鼠卵巢癌细胞的生长及转移可被claudin-3小干扰RNA（siRNA）所抑制[13]，并认为这种介导claudin-3基因沉默的siRNA可能是潜在的抗肿瘤药物。

综上所述，深入研究claudin-3蛋白与肿瘤的关系有可能成为肿瘤靶向治疗的新方向[14]。本研究显示claudin-3在鼻咽癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，但两者的差异无统计学意义（P = 0.599）。其中claudin-3阳性表达与患者性别、年龄、有无颈部淋巴结转移、血清VCA-IgA阳性率、病理分型等无明显相关性（P > 0.05），但同TNM分期相关，Ⅰ+Ⅱ期患者中claudin-3阳性率为34.38%，低于在Ⅲ+Ⅳ患者中claudin-3阳性率的80.00%，差异有统计学意义（P = 0.002）。在病理分期更高的鼻咽癌组织中claudin-3表达阳性率更高。血清VCA-IgA阴性的鼻咽癌组织中的claudin-3表达阳性率16.67%（1/6）低于血清VCA-IgA高滴度的病例中的claudin-3表达阳性率70.0%（7/10）（P < 0.05）。有多项研究[15-17]显示血清VCA-IgA滴度与鼻咽癌的临床分期有关，总结得出claudin-3表达升高与鼻咽癌临床分期有关，可能在鼻咽癌的病程发展中起一定的作用。

Al等[18]通过RT-PCR及Western blot研究发现，claudin-7在头颈部鳞癌中的表达与在周围正常组织中的表达相比明显降低。Suren等[19]对18例鼻咽癌组织及癌旁组织，用免疫组化方法检测研究claudins的表达与预后相关性，发现claudin-7表达与预后相关；Kondoh等[20]对28例扁桃体鳞状细胞癌组织及正常组织进行对照研究，用免疫组化方法分析claudin表达，结果显示在原发鳞状细胞癌和转移淋巴结中claudin-7均少表达或缺如，claudin-7表达下调表现在肿瘤进展的全过程。又有學者检测了32例喉癌患者的癌组织和癌旁组织中的claudin-7 mRNA的表达量，发现其在癌组织中较形态正常的癌旁组织出现明显下降[21-22]，提示claudin-7的表达与恶性肿瘤的组织病理学特点呈负相关，与肿瘤发展密切相关。故claudin-7普遍被认为是一种潜在的肿瘤抑制剂。claudin-7在癌旁正常组织中的阳性表达率为55.00%（11/20），而在鼻咽癌中的表达率为26.92%（14/52），两者阳性表达率比较差异有统计学意义（P = 0.025）；紧密连接蛋白claudin-7在不伴淋巴结转移的鼻咽癌组织中的表达（9/15），较伴有淋巴结转移的鼻咽癌组织（5/37）明显降低，两者差异有高度统计学意义（P = 0.001）。与以上对claudin-7在头颈部肿瘤中的研究类似，对于可能的原因国外有研究显示，转录因子Snail可与编码claudin-7基因的启动子的E.Box直接结合，抑制启动子活性，使claudin-7蛋白表达下调[23]。而claudin-7基因的启动子甲基化可使claudin-7蛋白表达降低[24]。claudin-7蛋白表达的降低或缺失，使紧密连接结构破坏、功能障碍，引起肿瘤细胞生长所需的生长因子和营养物质扩散，致肿瘤细胞生长失控，促进肿瘤的发生、发展和转移[25]，进一步支持claudin-7可能是肿瘤抑制剂。本研究显示claudin-7表达水平与临床病理参数、性别、年龄、血清VCA-IgA阳性率、病理分型及TMN分期无明显相关性（P > 0.05）。claudin-7在鼻咽癌中出现了表达的异常，紧密连接结构遭到破坏，细胞极性丧失，生长失控，与国外研究类似[26]。claudin-7表达下降甚缺失参与了肿瘤的发生过程，促进了肿瘤的发生、发展。

近年来，细胞连接功能异常在肿瘤发生发展过程中的作用逐渐受到重视，干预其中关键蛋白抑制肿瘤生长已经成为肿瘤研究的新热点。claudin-3和claudin-7表达异常与鼻咽癌的发生发展密切相关，对其进行深入研究，有望成为治疗鼻咽癌的新靶点。

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（收稿日期：2018-05-04 本文編辑：金 虹）