校园周边熟食中金黄色葡萄球的分离及肠毒素基因检测

曾宝锋，蒋敏，王洪志，陈娟，赵燕英，唐俊妮

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

金黄色葡萄球菌是一种重要的条件致病菌，广泛存在于自然界中，污染食品的几率很大，同时，金黄色葡萄球菌在适宜的条件下能够产生肠毒素，引发食物中毒，它引起的食物中毒通常占居细菌性食物中毒的第3位[1,2]。近年来，我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也逐渐增多，如2016年芜湖市的一家燃面馆发生一起食物中毒事件，有3人在进食后2～3 h内均出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，经流行病学调查和实验室检测结果证实这是一起由金黄色葡萄球菌及其肠毒素引起的食物中毒事件[3]。欧秀华等[4]从引起食物中毒的牛肉酱标本中分离到金黄色葡萄球菌并检测出肠毒素。李光辉等[5]针对2003～2015年金黄色葡萄球菌食物中毒暴发资料进行统计与分析，发现报道的金黄色葡萄球菌食物中毒事件86起，累计发病2431人，死亡人数0，并认为肠毒素A引起食物中毒事件最多，其次为肠毒素 C。吕国平等[6]对石家庄市2007～2013年金黄色葡萄球菌食物中毒株进行分子分型和传统肠毒素检测，发现传统肠毒素sea，seb，sec，sed，see五种类型都有检出，认为食物源毒株可产生多种葡萄球菌肠毒素。蔡华等[7]评估上海市居民食用凉拌菜引起金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的风险，发现上海市市售凉拌菜中 3.39%（21/620）的样品可检出金黄色葡萄球菌，每次食用凉拌菜发生金黄色葡萄球菌中毒的概率为0.04%，每年可能的患病例数为51.81万例。国译丹等[8]分析 2010～2016年从云南省16个地州市农贸市场、超市及酒店餐馆采样并监测14大类食品23723份，检出金黄色葡萄球菌675株，检出率为2.85%，其中，肉与肉制品、速冻米面制品、餐饮食品污染金黄色葡萄球菌较为严重。从上述研究可以看出金黄色葡萄球菌极易污染各类食品，并且金黄色葡萄球菌的污染主要是由食品原料本身带菌以及食品在加工过程中由操作人员而引起[9]。

为了解校园周边熟食中金黄色葡萄球菌的污染情况，本研究采集校园周边食品市场及周边摊点熟食进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定，并针对菌株携带的21种肠毒素基因进行检测。目的是为了了解校园周边熟食中金黄色葡萄球菌的污染及其肠毒素基因的分布情况，研究结果为校园周边金黄色葡萄球菌引起的食品安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 培养基、试剂、菌株

7.5%的NaCl肉汤、Baird-Parker（BP）琼脂基础、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（trypticase soy broth, TSB），均购自海博生物技术有限公司；TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCL，1 mmol/L pH 8.0乙二胺四乙酸）购自大连TaKaRa 公司；2×PCR Master Mix、DL 2000 DNA Marker，均购自北京擎科新业生物技术有限公司；金黄色葡萄球菌ATCC6538作为参考菌株，由本实验室保存。

1.2 仪器与设备

Eppendorf 5804R型冷冻离心机，购自Eppendorf生命科技公司；PTC-200 PCR仪、Versadoc 2000凝胶成像仪，均购自美国Bio-Rad公司；DYY-6C电泳仪，购自北京六一仪器厂；HZQ-F160全温震荡培养箱，购自上海齐欣科学仪器有限公司。

1.3 引物设计与合成

16S rDNA引物以及21种金黄色葡萄球菌肠毒素基因引物参考王琼等[10]。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 食品样品的采集与分离纯化

样品采集时间为2016年夏季（4～7月），在校园周边农贸市场共采集食品熟食样品57份，路边小摊共采集食品熟食样品32份，合计89份。

每份样品约100 g左右，放入无菌采样袋中，送回实验室进行细菌分离。所有食品样品均按照

GB4789.10《食品微生物学检验-金黄色葡萄球菌检验》进行操作[11]。分离的菌株于-80 ℃超低温甘油保存备用。

1.5 DNA提取

参照Kalia等[12]和Tang等[13]的方法提取样本的DNA，于-20 ℃保存备用。

1.6 金黄色葡萄球菌的16S rDNA测序鉴定

以提取的DNA为模板，以16S rDNA的引物进行PCR扩增，同时设对照。PCR扩增反应体系：20 μL总反应体系：10 μL 2×PCR Master Mix，上下游引物各0.4 μL，DNA 模板1 μL，补水至20 μL。扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；进入PCR循环，95 ℃变性40 s，55 ℃ 退火50 s，72 ℃延伸40 s，35个循环，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。扩增产物进行电泳检测和送样测序，样品测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.7 肠毒素基因的PCR检测

参考王琼等[10]对金黄色葡萄球菌的肠毒素基因进行PCR扩检测，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳和成像系统进行检测，并记录结果。

1.8 数据分析

数据采用Excel进行处理。

2 结果与分析

2.1 样品采集和细菌的分离鉴定结果

图1 部分菌株16S rDNA的PCR检测结果Fig.1 The 16S rDNA PCR detection results for partial S. aureus strains

2016年4～7月，在校园周边的农贸市场及路边小摊共采集食品样品89份，样品采样来源和采样时间详见表 1。分离的金黄色葡萄球菌在选择性分离培养基Baird-Parker平板上菌落形态为灰黑色、周围有浑浊带、边缘为淡色、外层有透明带，比较好辨认，革兰染色也验证分离菌株为革兰阳性，并且在显微镜下呈圆形，葡萄串状。进一步对分离菌株进行 16S rDNA的特异性PCR检测（图1）和序列比对分析，最终确认获得 71株金黄色葡萄球菌。样品总的分离率为79.78%（71/89），其中，农贸市场分离46株，分离率为80.7%（46/57）；路边小摊分离25株，分离率为78.1%（25/32）；金黄色葡萄球菌在不同类别食品中的分离率见表1，由表1可以看出，烘焙食品类样品共5份，检出5份，分离率100%；豆类制品共14份，检出12份，分离率85.7%；袋装类小食品共7份，检出6份，分离率85.7%；凉拌菜类共25份，检出21份，分离率84.0%；米面制品类共18份，检出15份，分离率83.3%；熟食肉类制品共17份，检出11份，分离率64.7%；水果类2份未分离出；辣椒面只有1份样品，从中分离出1株细菌。可见，校园周边食品样品中，金黄色葡萄球菌的分离率较高，大多数食品为即食食品，存在食品不安全隐患。

表1 金黄色葡萄球菌分离菌株样品来源、种类、采样时间及分离结果Table 1 the sampling sources, types, time, and isolation results of S. aureus

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7.12 鸡爪 农贸市场 + SA-16-43凉拌菜类（共25份，检出21份，分离率84.0%）米面制品类（共18份，检出15份，分离率83.3%）7.12 猪大肠 农贸市场 - -7.15 卤鸡爪 农贸市场 + SA-16-57 7.17 鸭肝 农贸市场 + SA-16-61 7.17 卤肉 农贸市场 - -7.17 宫保鸡丁 农贸市场 - -7.19 熟猪肠 农贸市场 - -7.19 卤鸡爪 农贸市场 - -7.22 卤鸡爪 路边小摊 - -4.14 凉拌笋 农贸市场 + SA-16-11 4.24 凉拌莲藕 农贸市场 + SA-16-20 4.24 凉拌海带 农贸市场 + SA-16-21 4.24 拌土豆丝 农贸市场 + SA-16-22 4.24 凉拌花菜 农贸市场 + SA-16-25 5.08 黄瓜丝 农贸市场 + SA-16-30 5.08 豌豆泥 农贸市场 + SA-16-35 5.08 凉菜 农贸市场 + SA-16-36 7.12 豌豆泥 农贸市场 + SA-16-40 7.12 凉拌笋 农贸市场 - -7.12 凉拌海带 路边小摊 - -7.12 凉拌海带 农贸市场 + SA-16-47 7.15 凉拌藕 农贸市场 + SA-16-50 7.15 豌豆泥 农贸市场 + SA-16-52 7.15 凉拌豆角 农贸市场 + SA-16-53 7.15 凉拌蕨菜 农贸市场 + SA-16-54 7.15 凉拌粉丝 农贸市场 + SA-16-55 7.15 海带丝 农贸市场 + SA-16-58 7.15 凉拌竹笋 农贸市场 + SA-16-59 7.17 凉拌丝瓜 农贸市场 - -7.17 凉拌辣椒 农贸市场 + SA-16-62 7.19 凉拌笋 农贸市场 + SA-16-65 7.22 腌笋丝 路边小摊 + SA-16-68 7.22 腌菜丝 路边小摊 + SA-16-70 7.22 萝卜丝 农贸市场 - -4.08 肉馅包子 农贸市场 + SA-16-2 4.08 凉粉 路边小摊 + SA-16-3 4.12 寿司 路边小摊 + SA-16-9 4.14 梅干菜薄饼 路边小摊 + SA-16-14 4.16 鸡蛋饼 路边小摊 + SA-16-18 4.24 凉皮 农贸市场 + SA-16-24 4.24 葱油饼 路边小摊 - -5.08 薄饼 路边小摊 + SA-16-28 5.08 鸡蛋皮 农贸市场 + SA-16-37

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注：“+”代表分离出金黄色葡萄球菌，“-”代表未分离出金黄色葡萄球菌。

2.2 金黄色葡萄球菌分离菌株肠毒素基因检测结果

图2 金黄色葡萄球菌分离菌株肠毒素基因的检出情况Fig.2 the detection results of staphylococcal enterotoxin genes of S. aureus food isolates

针对肠毒素基因的详细检出结果见表2。PCR检测结果表明：分离的71株金黄色葡萄球菌中，有46株分离菌株检出携带肠毒素基因，携带肠毒素基因菌株的检出率为64.78%（46/71）。由表2可见，携带1种肠毒素基因型的共有23株分离菌株；携带2种肠毒素基因型的共7株；携带3种肠毒素基因型的有1株分离菌株；携带4种肠毒素基因型的有1株分离菌株；携带5种肠毒素基因型的有4株分离菌株；还有4株分离菌株同时携带6种肠毒素基因；3株分离菌株携带7种肠毒素基因；1株分离菌株携带8种肠毒素基因；2株菌株携带11种肠毒素基因。

21种肠毒素基因中，共有15种基因被检出（详见图2），包括3种传统肠毒素基因和12种新型肠毒素基因，其中，sex有40株检出，检出率最高，为86.96%（40/46）；sei和sem各有15株检出，检出率为32.61%（15/46）；seo和sen各有14株检出，检出率为30.43%（14/46）；set有10株检出，检出率为21.74%（10/46）；seg有6株检出，检出率为13.04%（6/46）；sea、seb、ser各有5株检出，检出率为10.87%（5/46）；sej、seu各有3株检出，检出率为6.52%（3/46）；sek、seq各有2株检出，检出率为4.34%（2/46）；sed有1株检出，检出率为2.17（1/46）%；肠毒素基因sec、see、seh、sel、sep和ses未检出。校园周边熟食分离的金黄色葡萄球菌中肠毒素基因的携带率较高。

表2 金黄色葡萄球菌食品分离菌株肠毒素基因分布及类型Table 2 The distribution of enterotoxin genes in S. aureus food isolates

3 结论

3.1 近几年，有很多关于金黄色葡萄球菌食物中毒的报道，由金黄色葡菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌食物中毒的33%～45%[14,15]。金黄色葡萄球菌在食物中的污染率也较高，雷云瑞等[16]在54份样品中的检出率达42.6%；苑学霞[17]在130份生牛乳中样品中的检出率为43.85%。本研究从校园周边市场和小摊贩采集的89份食品中，污染率高达79.78%。其中，烘焙食品及糕点样品的污染率为100%；豆类制品、袋装类小食品、凉拌菜类、米面制品、熟食肉类等的污染率也较高。另外，农贸市场采样的污染率为80.7%；路边小摊采样的污染率为78.1%，农贸市场和路边小摊的污染率较为接近。我们的研究结果高于其他报道，分析原因可能与采样时间、采样种类以及样品所处环境有关。采样时间是在夏季，采样种类大多为熟食即食食品。校园周边熟食中金黄色葡萄球菌的污染率较高。因此，应加强对校园周边食物中金黄色葡萄球菌的污染调查。

3.2 另一方面，由于肠毒素可引起食物中毒，研究肠毒素基因在金黄色葡萄球菌中的分布也非常重要。目前发现金黄色葡萄球菌肠毒素有许多不同的血清型[18,19]。从现有的报道可以看出，金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检出率可高达93.5%[20]。顾其芳等[21]从上海地区生牛乳中分离的金黄色葡萄球菌携带肠毒素基因的阳性率达53.1%；刘思超等[22]从惠州市熟肉制品中分离的金黄色葡萄球菌携带肠毒素基因的阳性率达41.16%。本研究中，我们共检测了21种肠毒素基因，检出了15种不同类型的肠毒素基因。71株菌株有46株分离菌株携带肠毒素基因，携带肠毒素基因菌株的检出率为64.78%，携带两种及两种以上肠毒素基因的菌株占50%（23/46）。传统肠毒素基因检出sea、seb和sed。新型肠毒素基因中，sex、sei、sem、seo、sen检出率较高，其中sex检出率最高为86.96%（40/46）。齐欢欢等[23]对内蒙古地区乳源金黄色葡萄球菌的检测结果也显示新型肠毒素基因检出率高于传统肠毒素基因。McLauchlin等[24]调查引起食物中毒的23株金黄色葡萄球菌，没有检测到传统肠毒素基因，但每株菌都携带一种或者多种新型肠毒素基因。黄嘉慧等[25]从我国39个城市采集市售食用菌样本，其中分离的金黄色葡萄球菌也发现新型肠毒素基因检出率高。另外，Becker等[26]研究了人血液和人鼻腔分离出的429株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因分布情况，以及Akineden等[27]对患乳腺炎奶牛产的牛奶中分离的103株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因进行检测，都显示新型肠毒素检出率较高，与本研究结果具有一致性。这些结果表明新型肠毒素可能对人体健康同样具有潜在威胁[28]。因此，未来应加强对新型肠毒素致病性研究。

3.3 进一步从单个菌株携带肠毒素基因种类来分析，我们发现大多数菌株具有不同的肠毒素基因型，从另一个侧面也反映了菌株的遗传背景多样性。23株菌株携带两种及以上的肠毒素基因，有4株菌株甚至携带6种肠毒素基因；3株菌株携带7种肠毒素基因；1株分离菌株携带8种肠毒素基因；2株分离菌株携带11种肠毒素基因。说明食物源金黄色葡萄球菌毒株可产多种类型葡萄球菌肠毒素，并且肠毒素基因在不同食物源毒株中的分布具有多样性。本研究的缺陷是未对菌株进行分子分型，以后的工作应加强这方面的研究。

3.4 综上，通过本研究，我们发现校园周边熟食中金黄色葡萄球菌分离率和肠毒素基因携带率较高，新型肠毒素基因检测率高于传统肠毒素基因型，研究结果为金黄色葡萄球菌食品安全提供参考依据。