超高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健食品中14种功效成分

杨惠成，王海鸣，林绪，燕云，何晓峰

（广州广电计量检测股份有限公司，广东广州 510065）

随着人类生活水平的提高，人们已经不再满足于吃饱穿暖，而是更加关注于饮食健康，通过饮食改善自身的身体状况，营养保健成为更多人关注的焦点。保健品作为一种特殊的食品，旨在调节人体功能，补充人体所需的营养素。自保健品问世以来，受到很多消费者的青睐。保健品也获得了快速发展，产品琳琅满目。然而有许多不法商家为了谋取暴利，制造各种各样的劣质保健品，使我国的保健食品市场存在很多安全隐患，急需开展快速检测保健食品的质量的方法。

功效成分是保健食品功能保健功能的关键所在，也是产品质量的主要指标，因此功效成分检测便成为国内外保健食品开发研究十分重视的一个环节。要使保健食品长期稳定的健康发展，弄清其功效成分并解决测定方法有着重要的意义[1]。现有的保健食品功效成分的检测方法有分光光度法[2]、气相色谱法[2]、高效液相色谱法[3～17]、液相色谱-质谱法[18]等，其中高效液相色谱法为最常见的检测方法，但检测项目单一，对于含有多种功效成分的保健食品，由于基质的干扰和某些目标物缺乏较强的紫外或荧光吸收，导致检测效果不佳，故难以实现多组分的同时测定，而且其灵敏度也无法达到对相关提取物中低浓度样品的分析。因此，本文利用液相色谱-串联质谱的优势，建立准确、快速测定保健食品中14种功效成分同时测定的分析方法，不仅可以对单一组分不同功能的各类保健食品提供一种优良的检测方法，而且还可以对多种功效成分的保健食品建立一种检测方法，为保健食品的生产研发和监管提供高效灵敏的定性定量检测手段。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯），乙酸铵（分析纯）：默克公司。

标准物质：绿原酸（Chlorogenic acid，327-97-9，97.2%）、没食子酸（Gallic acid，149-91-7，99.47%）、丹参素钠（Sodium Danshensu，67920-52-9，98.1%）、芦荟苷（Barbaloin，1415-73-2，94.4%）、白藜芦醇（Resveratro，501-36-0，99.4%）、红景天苷（Salidroside，10338-51-9，98.8%）、芦丁（Rutinum，153-18-4，99.3%）、淫羊藿苷（Icariin，489-32-7，94.2%）、苦杏仁苷（Semen Armeniacae Amarum，29883-15-6，90.7%）、芍药苷（Paeoniflorin，23180-57-6，95.7%）、黄氏甲苷（Astragaloside，84687-43-4，97.4%）、腺苷（Adenosine，58-61-7，99.7%）、甘草酸（Glycyrrhizic acid，1405-86-3，93.0%）、大蒜素（Allicin，539-86-6，97.3%）：SIGMA公司。

1.2 仪器设备

AB4500超高效液相色谱-质谱/质谱联用仪（美国SCIEX公司），超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），ME203E电子分析天平（瑞士梅特勒），XS205DU电子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.3 试剂配制

1.3.1 标准储备液

准确称取各标准物质20 mg，分别置于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，配成2.0 mg/mL单个标准储备液。

1.3.2 混合标准中间液

由于各目标化合物在仪器的响应值存在差异，因此需要配置不同浓度的混合标准中间液，配成浓度分别为100 μg/mL，10 μg/mL，1 μg/mL 的混合标准中间液。

1.3.3 标准使用液

用甲醇配制标准使用液。绿原酸、没食子酸、丹参素钠、白藜芦醇、红景天苷、黄氏甲苷、甘草酸、大蒜素的质量浓度为 1000 ng/mL、500 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL；芦丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍药苷的质量浓度为100 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL；芦荟苷、腺苷的质量浓度为 10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL、0.1 ng/mL、0.05 ng/mL。

1.4 实验方法

1.4.1 样品前处理

准确称取各类样品2.00 g，至100 mL容量瓶中，加入甲醇50 mL，超声提取15 min，冷却后，用甲醇定容至刻度，经0.22 μm滤头过滤，滤液作为测试液。

1.4.2 色谱条件

色谱柱：Venusil MP C18 （100 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：乙腈，流动相梯度：0～3 min，10% B保持不变，3～5 min，90%B保持不变；5～7 min，10% B保持不变；样量：5 μL；柱温：40 ℃。

1.4.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子（ESI）源；正离子负离子交替扫描；扫描方式：多反应监测（MRM）；气帘气流量：30 L/min；雾化气流量：50 L/min；辅助加热气流量：50 L/min；碰撞气：Medium；辅助加热气温度：500 ℃；喷雾电压：5000 V（ESI+）/-4500 V（ESI-）；离子源温度：500 ℃。

表1 目标化合物的质谱检测参数Table 1 MRM parameters for tandem mass spectrometry

1.4.4 线性关系

用空白样品基质作为溶剂，配制不同浓度的混合标准溶液，用0.22 µm微孔针头滤膜过滤，由低浓度至高浓度进行 HPLC-MS/MS分析，每个浓度重复 3次，绘制峰面积-质量浓度标准曲线，并计算线性范围，相关系数，精密度和以信噪比 RSN=3对应质量浓度确定检出限。

1.4.5 回收率

取2份同一样品提取液1 mL，其中1份用甲醇定容至100 mL，另一份加入混合标准溶液再用甲醇定容至100 mL。在同样色谱条件下进样检测6次，根据加标浓度前后的变化及加标量计算回收率。

1.5 数据统计分析

数据采用 SPSS 21.0软件进行统计学分析，ANOVE进行方差分析，Duncan对提取条件进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 超声时间的选择

通过查阅资料得知，14种功效成分均是醇溶性物质，其中芦丁溶于甲醇，微溶于乙醇。因此，本文采用甲醇作为提取溶剂。超声时间对灵芝胶囊中功效成分提取浓度的影响如表2所示，在5～15 min时，提取时间对灵芝胶囊中所含功效成分的提取浓度逐渐增大，且差异性显著（p＜0.05）。在15～20 min时，超声时间对灵芝胶囊功效成分的浓度随之下降，但差异性不显著。

超声时间对灵芝胶囊中 14种功效成分加标回收率的影响如表3所示，取灵芝胶囊，添加2 μg/kg、20 μg/kg、200 μg/kg三个浓度混合标准液进行超声处理。由表3可知，超声时间为5 min、10 min、15 min、20 min，14种化合物的回收率范围分别为75.90%～85.03%、82.03%～98.81%、86.83%～108.44%、86.95%～108.02%。化合物在超声时间为在5 min至15 min之间，随着提取时间的延长，化合物的回收率增大。超声时间在20 min时的回收率与15 min时的回收率没有显著性差异（p＞0.05）。因此，本文选用15 min作为超声时间。

表2 超声时间对灵芝胶囊功效成分提取浓度的影响Table 2 Effect of ultrasonic time on the concentration of effective components in Ganoderma lucidum capsules (n=3)

表3 超声时间对功效成分加标回收率的影响Table 3 Effect of ultrasonic time on recovery rate of functional ingredients (n=3)

2.2 质谱条件的优化

大蒜素、甘草酸、腺苷、黄氏甲苷在Q1 MS负离子模式下，响应较低，达不到检出限要求，在正离子模式下形成[M+H]+峰，响应较高；绿原酸、没食子酸、芦荟苷、白藜芦醇、红景天苷、芦丁在Q1 MS负离子模式下形成的[M-H]-峰响应最高；淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍药苷在Q1 MS负离子模式下形成的[M+HCOO]-峰响应最高，因此采用正负离子交替扫描的方式进行试验。调节CE参数，使母离子的强度占子离子强度的1/3～1/4为最佳，从质谱图中选择1个信号较强的子离子作为定性离子，离子丰度最强的子离子为定量离子，采用针泵流动注射标准溶液，进行参数优化。质谱参数确定后，连接液相色谱进样，由于各物质的离子源温度、辅助加热气、干燥气、气帘气、电喷雾电压等参数与在单纯质谱条件下发生变化，因此选择适中的一组参数在液相条件下进行再优化，最终得到最佳的去簇能量（DP）和碰撞能量（CE）。

2.3 色谱条件的优化

本方法比较了乙酸铵水溶液-乙腈流动相体系和甲酸水溶液-乙腈流动相体系的分离效果，发现两者所得的峰形对称，目标化合物均在5 min内检出，但两者在响应值指标上甲酸水-乙腈体系优于乙酸铵-乙腈体系，故而本方法采用甲酸水溶液-乙腈作为流动相。图1为分别采用0.1%甲酸水-乙腈和5 mmol/L乙酸铵-乙腈作为流动相时对14种目标化合物的响应值。

在流动相中加酸可抑制电离、改善峰形，但酸浓度过高会抑制在负离子模式下的离子化效率。同时考虑到 0.1%的甲酸水溶液已经足以满足检出限（见2.5.1）响应的要求，过高浓度的酸溶液对色谱柱寿命有一定的影响，且不利于离子源中溶剂的高效脱除，所以最终选择了 0.1%的甲酸水溶液-乙腈作为流动相。

图1 相同浓度的目标化合物在不同流动相中的响应值Fig.1 Response values in different mobile phase

2.4 功效成分离子色谱图

功效成分提取离子色谱图见图2。由图2可以看出，采用2.2和2.3确定的质谱条件和色谱条件，14种目标化合物均在4 min内完成出峰，大部分物质可以较好的进行分离，绿原酸、芦丁、苦杏仁苷和大蒜素，白藜芦醇和黄氏甲苷无法较好的分离。同时，由于采用MS/MS检测器，通过MRM模式进行检测14种目标化合物的特征离子对，对没有完全分离的组分，仍可以进行准确定性及定量。结果表明，该色谱条件和质谱条件适宜14种目标化合物的分析。

图2 14种植物功效成分的提取离子色谱图Fig.2 Extraction ion chromatography of 14 kinds of functional components

2.5 方法验证

2.5.1 方法的线性范围、检出限、定量限

由于保健食品均含有一种或多种功效成分，其成分较为复杂（如肽类、糖类、脂类等），用甲醇提取后，仍含有各种有机物，这些物质与目标化合物共流出色谱柱进入电离源时，将严重影响目标化合物的离子化过程，对目标物的信号产生抑制或增强的效果。保健品基质对14种功效成分的影响如表4所示，由表可知，标液在空白基质中的峰面积与标液在流动相中的峰面积的比值均小于1.0，说明保健食品的基质对功效成分具有离子抑制效应。

为了消除基质带来的离子抑制效应对定量测定的影响，试验采用空白样品基质作为溶剂，配制适当浓度的标准工作溶液。绿原酸、没食子酸、丹参素钠、白藜芦醇、红景天苷、黄氏甲苷、甘草酸、大蒜素在5～1000 ng/mL，芦丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍药苷在0.5～100 ng/mL，芦荟苷、腺苷在0.05～10 ng/mL，依次进样，以14种目标峰的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，分别得到标准曲线及线性方程，按3倍信噪比确定方法的检出限，10倍信噪比确定方法的定量限。结果表明：采用空白基质配制标准曲线能有效减少基质效应带来的影响，范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数均＞0.998。绿原酸、没食子酸、丹参素钠、白藜芦醇、红景天苷、黄氏甲苷、甘草酸、大蒜素检出限为75 μg/kg，芦荟苷、腺苷检出限为0.75 μg/kg，芦丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍药苷检出限为7.5 μg/kg。14种功效成分的线性方程、线性系数、检出限和定量限等参数见表5。

表4 保健食品基质对功效成分的影响Table 4 Effect of health food substrates on functional ingredients

表5 14种化合物的线性相关系数、检出限和定量限Table 5 Linearity, detection, and quantification limits for 14 kinds of functional components

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黄氏甲苷 y=102.05504x+37.73299 0.9986 5～1000 75 250腺苷 y=6.61679e4x+2626.86279 0.9991 0.05～10 0.75 2.5甘草酸 y=1640.93776x+3345.41165 0.9983 5～1000 75 250大蒜素 y=4120.93650x+14471.76835 0.9990 5～1000 75 250

2.5.2 方法的回收率和精密度

取灵芝胶囊、藏域红天胶囊、虫草菌丝体口服液添加混合标准溶液得绿原酸、没食子酸、丹参素钠、白藜芦醇、红景天苷、黄氏甲苷、甘草酸、大蒜素浓度为 100 μg/kg、200 μg/kg、500 μg/kg；芦荟苷、腺苷浓度为 1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg；芦丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍药苷浓度为 10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，每个浓度6个平行，按照1.4.5的方式进行添加实验。检测结果在1 μg/kg～500 μg/kg浓度范围内，扣除空白值后，加标回收率在83.42%～108.44%范围内，所有目标峰的相对标准偏差均小于5.0%，详见表6。

表6 方法准确度和精密度Table 6 Accuracy and precision for 14 kinds of functional components

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黄氏甲苷腺苷甘草酸100 92.94 3.29 103.20 1.99 83.42 2.98 200 92.56 2.10 98.92 1.98 90.08 1.49 500 91.30 2.10 100.21 3.43 86.53 2.05 1 107.64 2.96 91.23 1.08 91.82 3.57 2 106.32 4.43 99.08 2.00 87.84 1.77 5 103.64 3.86 90.54 1.76 101.06 4.55 100 105.22 2.05 90.94 1.86 93.67 4.65 200 104.02 2.67 94.26 3.90 86.83 2.35 500 102.53 3.01 95.65 2.94 94.18 1.60大蒜素100 92.91 1.52 91.23 1.97 88.67 1.15 200 105.04 1.79 88.82 2.29 88.49 2.31 500 97.16 1.09 86.34 1.86 8706 1 99

2.5.3 样品适用性实验

图3 不同样品的植物功效成分的总离子流色谱图Fig.3 TIC of functional components in different samples

用本方法对市售的保健食品（洋参淫羊藿软胶囊、虫草菌丝体口服液、红景天参杞牛磺酸口服液）进行检测，分别检测出淫羊藿苷（18.0 g/kg，该洋参淫羊藿软胶囊中淫羊藿苷的浓度较高，在前处理过程中，将测试液逐级稀释4000倍后上机测定）、腺苷（0.12 g/kg）、红景天苷（2.4 g/kg），受干扰小，分析速度快（分析时间小于4 min），实现了一种方法适用于多种保健食品的功效成分的检测，离子色谱图见图3。

3 结论

3.1 本文通过对保健食品中绿原酸、没食子酸、丹参素钠、白藜芦醇、红景天苷、黄氏甲苷、甘草酸、大蒜素、芦丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍药苷、芦荟苷、腺苷检测条件的探索，当甲醇提取，超声15 min，流动相为 0.1%的甲酸水溶液-乙腈，正负离子交替扫描时检测条件最佳。该方法能在4 min内完成出峰，能很好的将14种植物功效成分分离，以信噪比为3和10分别计算出14种功效成分的检出限及定量限，其中绿原酸、没食子酸、丹参素钠、白藜芦醇、红景天苷、黄氏甲苷、甘草酸、大蒜素检出限为75 μg/kg，定量限为 250 μg/kg；芦荟苷、腺苷检出限为 0.75 μg/kg，定量限为2.5 μg/kg；芦丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍药苷检出限为7.5 μg/kg，定量限为25 μg/kg。

3.2 对于保健食品中多种功效成分同时测定的方法一直是国内学者研究的方向，本文建立了一种超高效液相色谱-串联质谱同时测定保健食品中植物功效成分的检测方法，本方法具有前处理简单，快捷简便、高效高通量等特点，可为含有多种功效成分的保健食品的生产、研发及质量监控提供高效、准确和灵敏的检测手段。