龙眼核精油的体外抗氧化活性及其保鲜效果

蔡文韬，袁学文，陈秋苑，余伟业，冯丽娜

(广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州 510303）

龙眼（Dimocarpus longan Lour）又名“桂圆”，具较高的营养价值和保健功能，素有南“桂圆”北“人参”之说[1]。龙眼核为龙眼种仁，占新鲜果实总重量的17%[2]，其味苦、涩，性平，气微，含大量淀粉、还原糖和蛋白质等营养要素，具有止血、定痛和燥湿等功效[3,4]。随着龙眼种植面积扩大，产量持续增长，造成龙眼产量过剩，且龙眼深加工产品如龙眼酒、龙眼干和龙眼罐头等的出现，大量的龙眼核被废弃，利用率趋近于零，造成资源的极大浪费和环境污染[5]。

植物精油经植物萃取，含特殊芳香气味，主要由脂肪族类、芳香族类、菇烯类化合物及含氮、硫化合物组成[6]，具有净化空气、杀菌、提供细胞营养、提高免疫功能和天然防腐等优点[7]。在美国，多种精油类产品通过食品药品管理局（FDA）和环境保护署（EPA）的批准后，纳入可用于食用消费的“一般认为安全的”（GRAS）名单中[8]。在果蔬保鲜方面，植物精油无残留、无环境污染及无抗药性，符合果蔬保鲜朝绿色安全方向的发展趋势相符[9～11]。近年来，国内在植物精油用于果蔬保鲜方面进行过相关研究，并取得一定成效。如韩林等[12]人研究不同浓度龙眼核精油经浸泡处理对草莓采后低温保鲜效果。本文将龙眼加工过程产生的废弃物龙眼核作为原料，提取龙眼核精油，考察精油对DPPH·、·OH、NaNO2的清除能力及龙眼果实的保鲜效果，一方面，可为开发天然果蔬保鲜方法提供理论基础和技术依据，另一方面，对实现资源可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 原料

龙眼购买于广州市白云区槎龙果品市场，品种为泰国龙眼，挑选外观完好、大小一致的果实进行实验。

龙眼核将购买的龙眼去皮、肉，留核，置于60 ℃电热鼓风干燥箱中干燥3 h后磨碎，得龙眼核粉；无水乙醇（购自广州泽明科技发展有限公司）、氢氧化钠（购自广州化学试剂厂）、DPPH、无水乙醇、抗坏血酸、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、盐酸萘乙二胺、酚酞、正己烷，购自广州爱彤生物制品有限公司。

1.2 主要仪器设备

CN61M/STSXT型索氏提取器，北京中西远大科技有限公司；DHG-9030型电热鼓风干燥箱，上海-恒科学仪器有限公司；YP2002型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；WZBC3型数显折光仪，上海仪电物理光学仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SPX型生化培养箱，上海科恒实业发展有限公司；FA2004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；MJ-BL25C4型搅拌机，广东美的精品电器制造有限公司；NC-BH05型NICO（尼珂）超纯水机，重庆隆暾科技有限公司；BCD-201E/A型冰箱，海信容声（广东）冰箱有限公司；752N紫外可见分光光度计，上海精科实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 龙眼核精油提取

参照韩林等[12]实验方法。

称取定量龙眼核粉，以正己烷为提取剂，利用索氏提取器在80 ℃下提取4 h，经旋转蒸发仪浓缩，得正己烷提取液，置于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中保存、备用。

1.3.2 龙眼核精油体外抗氧化性研究

1.3.2.1 龙眼核精油清除DPPH[13,14]

以 70%乙醇为溶剂，将龙眼核精油分别配成 1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL、4.0 mg/mL系列浓度，分别取2 mL龙眼核精油，加入2 mL无水乙醇，于517 nm波长处测定其吸光度(Aj)；另取精油 2 mL，分别加入2×10-4mol/mL DPPH·溶液2 mL，混匀后置暗处30 min，相同条件下测其吸光度(Ai)；同时测2×10-4mol/mL DPPH·溶液的吸光度(A0)。以Vc作为阳性对照，计算龙眼核精油对DPPH·的抑制率。

1.3.2.2 龙眼核精油清除·OH[15]

根据表1加入反应试剂，摇匀后置于37 ℃水浴锅中，60 min后取出，在510 nm波长处测定其吸光度，计算对·OH的清除能力：

表1 ·OH反应体系加样表Table 1 ·OH reaction system table of adding sample

1.3.2.3 龙眼核精油清除NaNO2

NaNO2标准曲线的绘制：分别于10支25 mL具塞刻度试管内移入0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、l.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL NaNO2标准液（5 μg/mL）。

各加入0.4%对氨基苯磺酸溶液l mL，混合均匀后静置5 min，加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL，加水至刻度，混合均匀后静置15 min，在538 nm处测其吸光度。以亚硝酸钠含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.0292x-0.0076，R2=0.9991。

NaNO2清除率[16]：分别取 1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL的龙眼核精油移入25 mL比色管内，加入2 mL NaNO2标准溶液（5 μg/mL），于37 ℃恒温水浴中反应30 min后取出，立即加入0.4%对氨基苯磺酸溶液l mL，摇匀后静置5 min，加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL，加水至25 mL刻度，混合均匀后静置15 min，以零管作为空白，于波长538 nm处测吸光度。计算清除率，以Vc作阳性对照。

1.3.3 常温保鲜实验

参照韩林等[12]实验方法。以无水乙醇为溶剂，将精油稀释成 20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL系列浓度。将筛选出的龙眼分组，分别浸泡于不同浓度的龙眼核精油中，10 s后取出。装入做好标记的塑料篮中，置于培养箱，在常温下（25 ℃）内贮藏。每隔2 d观察龙眼果肉颜色变化、测定龙眼果皮褐变指数、失重率、可溶性固形物含量、可滴定酸含量等品质指标。并分别做无水乙醇和空白对照（CK），每实验重复3次。

1.3.3.1 龙眼果皮褐变指数评价

参照林河通等[17]实验方法，随机取 30颗龙眼果实，以龙眼内表皮褐变程度分为6个等级：1级，褐变面积为0%；2级：褐变面积＜25%；3级：褐变面积25%～50%；4级：褐变面积50%～75%；5级：褐变面积＞0.75%；6级：全部褐变。计算果皮褐变指数。

果皮褐变指数=Σ(褐变级数×该级果实数)/总果实数

1.3.3.2 龙眼失重率测定

失重率采用重量法测定[18]，计算失重率。

失重率＝（贮前质量-贮后质量）/贮前质量×100%

1.3.3.3 龙眼可溶性固形物含量测定[19]

取5.0 g龙眼果实样品研磨离心(4000 r/min，10 min)后过滤，在20 ℃下用手持式糖度计测定折射率，读数即为可溶性固形物含量。

1.3.3.4 龙眼可滴定酸含量测定

采用NaOH滴定法[20]，以柠檬酸百分数表示结果。随机取15颗果实，去皮、核，榨汁，经4层纱布过滤后搅拌均匀，称重，滴加酚酞，使用0.005 mol/L的NaOH溶液滴定，至30 s内不褪色为终点，计算可滴定酸含量。

注：V表示消耗 NaOH体积（L）；C表示 NaOH浓度（mol/L）；K为苹果酸换算系数；M表示测定时的果汁重（g）。

1.3.4 数据处理

使用SPSS 22.0软件对数据进行多重比较分析；使用Excel 2010软件进行数据汇总及作图。

2 结果与讨论

2.1 龙眼核精油对DPPH·的清除

DPPH·稳定性强，517 nm波长处有强吸收作用，在乙醇溶液中呈深紫色。自由基清除剂利用与其单电子配对原理，使其逐步退色，若有其它物质供给一个电子以配对此单电子，则会导致吸收消失，退色程度与其所接收的电子呈现出定量关系[21]，结果见图1。

图1 龙眼核精油与Vc对DPPH·的清除率比较Fig.1 Comparison of the scavenging rate of the essential oil fromLongan seed and Vc to DPPH·

由图 1可知，当龙眼核精油浓度处于 1.5～2.0 mg/mL，对DPPH·清除率增幅最大；随着样品浓度持续增大，清除率增幅趋向缓和；清除率和样品浓度之间呈一定化学计量关系，如果Y为清除率，x为样品质量浓度，则Y=2.8309x+8.4453，R2=0.882；IC50（样品清除50%的自由基所对应的浓度）=11.04 mg/mL。当样品浓度为1.5 mg/mL时，Vc对DPPH·的清除率达95%以上；当浓度处于1.5～4.0 mg/mL范围内，对DPPH·清除效果的增幅趋向缓和；清除率与 Vc溶液浓度的关系式为Y=0.2029x+95.39，R2=0.9223。龙眼核精油与Vc对DPPH·均有清除作用，清除效果受浓度影响明显（p＜0.05）；两者对DPPH·的清除效果均随浓度的增大而加强；当浓度相同时，龙眼核精油对DPPH·的清除作用远低于Vc溶液。

2.2 龙眼核精油对·OH的清除

图2 龙眼核精油与Vc对·OH的清除率比较Fig.2 Comparison of the scavenging rate of the essential oil fromLongan seed and Vc to ·OH

·OH作为活性氧中最具化学活性的自由基，几乎可与细胞中的一切生物大分子迅速产生反应，对人体最具威胁[22]，结果如图2所示。

由图2可知，龙眼核精油对·OH清除效果趋势明显，呈良好的浓度效应关系，与Vc对·OH的清除效果趋势不完全相同，研究结果与文良娟等[23]相符，清除效果受浓度影响显著（p＜0.05）。清除率与龙眼核精油浓度关系的回归方程为 Y=8.5268x+10.911，R2=0.9799；IC50=4.58 mg/mL；清除率与Vc溶液浓度的关系式为Y=5.2643x+48.426，R2=0.9769；IC50=0.30 mg/mL。

2.3 龙眼核精油对NaNO2的清除

图3 龙眼核精油与Vc对NaNO2的清除率比较Fig.3 Comparison of the scavenging rate of the essential oil fromLongan seed and Vc to NaNO2

不同浓度龙眼核精油对NaNO2的清除作用，结果如图3所示。由图3可知，龙眼核精油与Vc对亚硝酸钠均有良好清除能力，在试验浓度范围内对NaNO2的清除效果呈良好浓度效应关系；龙眼核精油对NaNO2的清除效果受浓度影响较显著。低浓度下，龙眼核精油对NaNO2的清除能力低于Vc；随着浓度升高，龙眼核精油对NaNO2的清除能力逐渐趋同于Vc溶液，当浓度均为3.5 mg/mL时龙眼核精油对NaNO2的清除效果与 Vc相当。清除率与龙眼核精油浓度的关系式为Y=0.1282x2+1.1171x+81.954，R2=0.9406；清除率与 Vc溶液浓度的关系式为 Y=0.2195x2-0.5483x+88.967，R2=0.9507，龙眼核精油与 Vc对NaNO2的IC50分别为0.12 mg/mL和0.01 mg/mL。

2.4 龙眼果皮褐变指变化

由图4可见，精油处理组与CK、无水乙醇组相比，不同浓度精油对龙眼果皮褐变均有一定程度的抑制作用，但不成线性关系。在常温（25 ℃）条件下，0～2 d内果皮褐变指数呈增长趋势；2～7 d内变化趋势平缓；贮藏7～11 d内，果皮褐变指数快速增加，当精油浓度为320 μg/mL时，褐变指数较高，保鲜效果不理想，可能是高浓度龙眼核精油对龙眼果实产生药害，加速果皮的褐变进程。当精油浓度为160 μg/mL时，果皮褐变指数最低，仅1.07，远小于最高的3.47，龙眼果皮的褐变进程减缓。经统计分析，精油处理组与CK组相比，对龙眼保鲜效果差异不显著（p＞0.05)。

图4 龙眼核精油对龙眼果皮褐变指数的影响Fig.4 Effects of postharvest treatments with essential oil from Longan seed on browning of longan peel index

2.5 龙眼在贮藏期间失重率变化

图5 龙眼核精油对龙眼失重率的影响Fig.5 Effects of postharvest treatments with essential oil from Longan seed on the weight loss

随着龙眼贮藏时间延长，部分龙眼发生酸败、皱缩，流汁，导致重量减轻。图5表明，龙眼随贮藏时间变化，重量逐渐减轻，贮藏7～11 d内，CK组的龙眼果实失重率高于精油处理组，贮藏时间为11 d时，CK组龙眼果实失重率高达22.00%，为各组最高，贮藏0～5 d时，浓度为320 μL/mL的精油处理组，龙眼果实重量减轻速度明显高于各组，第9 d后失重率急速上升，可能是精油浓度过高，对龙眼产生病害，促进其腐烂，导致龙眼酸败流汁严重，水分减少，从而使失重率上升。龙眼核精油浓度为80 μL/mL时，龙眼果实失重率为10.79%，为各组最低，不同龙眼核精油浓度对龙眼果实的保鲜效果之间差异性不显著（p＞0.05）。

2.6 龙眼可溶性固形物含量（TTS）变化

图6 龙眼核精油对龙眼TTS含量的影响Fig.6 Effects of postharvest treatments with essential oil from Longan seed on total soluble solids

TTS含量下降是龙眼本身降解酶的作用，使果肉自溶，果胶、纤维素等细胞壁物质及多糖转化为小分子物质，即龙眼果肉内部败坏[24]。图6表明，常温贮藏0～8 d，精油处理组龙眼的TTS含量变化趋势平缓，贮藏9 d～11 d内，龙眼TTS含量有所上升。经统计分析，不同龙眼核精油浓度间TTS含量的变化差异不显著（p＞0.05）。

2.7 龙眼可滴定酸含量(TA)变化

图7 龙眼核精油对龙眼TA含量的影响Fig.7 Effects of postharvest treatments with essential oil from Longan seed on titratable acidity

如图7所示，常温（25 ℃）贮藏0～2 d，龙眼果肉TA含量变化趋势平缓；贮藏2～5 d，精油处理组与CK组TA含量均呈下降趋势；贮藏5～7 d内，精油处理组TA含量呈缓慢上升趋势，7 d后，CK组与无水乙醇组的TA含量具有明显的上升趋势，经统计分析得出，精油处理组与CK组相比，TA含量差异不显著（p＞0.05），龙眼核精油对龙眼果实不具备明显的保鲜效果。有研究表明：贮藏初期，TA含量下降，与龙眼果实中的酸首先作为呼吸基质而被消耗有关，贮藏后期，TA含量快速上升，与龙眼酸腐病菌入侵引起果肉酸败有关[24]。赵云峰等[25]研究发现，采后龙眼果肉自溶时TA含量会有所增加，使果实品质下降。贮藏后期TA含量上升的原因可能还有：贮藏后期龙眼果肉发生褐变，使果汁颜色加深，滴定过程发生的颜色变化可能被果汁颜色所掩盖，导致滴加的氢氧化钠溶液过多，根据公式（3）计算出龙眼TA的含量偏高，从而出现快速上升的现象。普通龙眼品种TA含量一般在0.096%～0.109%之间[26]，本次研究结果得出，泰国龙眼TA含量与国内采摘的普通龙眼TA含量相差较大，可能是龙眼品种不同，TA含量存在较大差异。

3 结论

3.1 龙眼核精油对DPPH·、·OH及NaNO2均有一定的清除效果，在试验浓度范围内呈一定的量效关系。当浓度相同时，龙眼核精油对DPPH·的清除作用低于Vc溶液；随着浓度增高，龙眼核精油对·OH清除趋势与Vc不完全相同，后者上升趋势相对平缓，对NaNO2的清除能力逐渐趋同于Vc溶液；浓度较低时，精油对NaNO2的清除能力低于Vc；精油对DPPH·、·OH及NaNO2的IC50分别为11.04 mg/mL、4.58 mg/mL、0.12 mg/mL。龙眼核精油在不同的抗氧化体系中所表现出的清除作用之所以有差别，可能是龙眼核中的抗氧化活性成分对不同类型自由基的敏感性及作用机制存在差异造成。

3.2 适中的精油浓度可缓解龙眼果皮褐变指数、失重率及TA、TTS的损失速度，精油处理组与CK组之间的统计结果无显著性差异（p＞0.05），龙眼核精油在果实保鲜方面不具备明显的保鲜效果，高浓度龙眼核精油会对龙眼果实产生药害。

3.3 大量研究均表明植物精油在果蔬保鲜方面具备一定的保鲜效果，与本实验结果存在差异，可能是实验对象不同，龙眼具备较坚硬的外壳，在精油中的浸泡时间不足，达不到理想的保鲜效果。因此，后续进行相关研究时，应吸取本次实验的教训。龙眼核的利用价值还未被充分发掘出来，精油应用于果蔬保鲜的效果有待进一步深入，研究龙眼核精油的活性成分及其作用机理，将龙眼核精油应用于果蔬保鲜的最佳方法及用量等，研究出绿色安全、科学有效的生物源保鲜剂，应用于食品保鲜市场。