白乌鱼胴体粘液中耐热菌的耐热性及特征菌种鉴定

张龙翼，张崟，陈平平，陈婷婷，方鉴宇，王林果，柯欢，熊伟

（成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都 610106）

鱼类的皮肤上皮组织中分布有大量粘液细胞，在应激条件下可分泌粘液于体表[1]，构成对外界威胁的有效防护屏障，起到保护鱼体免遭外界环境中的病菌、寄生物和病毒侵袭等重要作用[2]。Smith等[3]对虹鳟鱼的体表粘液特性研究，认为虹鳟鱼体表粘液是不同于鱼体血液的另外一种免疫系统。Guo等[4]发现大鲵皮肤的黏液具有毒性，低剂量注射小鼠可致其出现水肿或痛觉，经腹腔给药可致小鼠死亡。Lobb等[5]从羊头鲷皮肤粘液中，分离出了2种形式的免疫球蛋白。我们课题组在对白乌鱼胴体粘液进行初步分析时发现，白乌鱼胴体粘液在经过煮沸处理后，其中仍然存在部分微生物[6]，但未对这些微生物进行分离鉴定。鉴于耐热微生物关系到后期烹调或加工鱼肉产品的质量安全，所以有必要进一步明确白乌鱼胴体粘液中的耐热微生物种属。

白乌鱼（Opniocepnalusargusvar kimnra）是我国自主培育的珍稀淡水鱼种，其肉质细嫩，营养丰富，除具有较高的食用价值外，还具有一定的药用和观赏价值，未来市场潜力巨大[7]。目前，国内外对白乌鱼胴体粘液中的功效成分、微生物等方面研究相对较少。由于白乌鱼宰杀后，其表面有较多粘液，而且其中还存在能耐高温的微生物，所以如果不对其中的微生物进行分离鉴定，不仅会引起烹调或精深加工产品的食用安全隐患，而且可能会使粘液中的一些功能性微生物随着粘液的废弃而浪费。此外，微生物通常能产生酶和功能性蛋白质，但是大部分微生物的耐热性不高[8]，尤其在微生物作为酶使用的时候，耐热性更加重要。因此，为了进一步分析白乌鱼胴体粘液中的特征微生物的生物特性，本文对白乌鱼胴体粘液的特征菌进行了分离纯化，并对特征菌进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 实验设备

实验所用的主要仪器有THZ-98C恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；LE104E/02电子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（北京科伟永兴仪器有限公司）；智能型电热恒温鼓风干燥箱（上海琅玹实验设备有限公司）；标准型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；无菌操作台（苏州市金净净化设备科技有限公司）；SPX-80型生化培养箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；UV756CRT紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；YM75ZI智能型不锈钢立式电热压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）；XW-80A旋涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）；FR980凝胶成像仪（上海复日科技仪器有限公司）；2720 thermal cycler PCR仪、3730XL测序仪（Applied Biosystems）。

1.1.2 实验材料

新鲜白乌鱼购自成都市龙泉驿区三联汽车城水产市场；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉购自成都金山化学试剂有限公司；酵母提取物购自广州市华粤瑞科科学器材有限公司；氯化钠（分析纯）购自成都科龙化工试剂厂；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（SK8255）、SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒（SK8131）、dNTP购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白乌鱼胴体粘液的收集

参考张龙翼等[6]的白乌鱼胴体粘液的收集方法。新鲜白乌鱼用自来水暂养，间隔半小时换一次水，连续3次，宰杀后刮去鱼鳞，然后用乳胶手套轻捋其体表，让粘液流入灭菌后的器皿中，分装后4 ℃保存备用。

1.2.2 白乌鱼胴体粘液的耐热性分析

取6份白乌鱼胴体粘液5 mL于离心管中，将其中5份离心管分别放在30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃、煮沸条件下热处理20 min。将0.5 mL纯水、0.5 mL新鲜粘液、0.5 mL 30 ℃处理粘液、0.5 mL 50 ℃处理粘液、0.5 mL 70 ℃处理粘液、0.5 mL 90 ℃处理粘液、0.5 mL煮沸处理粘液分别均匀接种到灭菌后的LB固体培养基中，再放入生化培养箱中，在 37 ℃恒温培养24 h，观察菌落生长状况，每组平行3次。

1.2.3 特征菌分离及形态观察

按无菌操作用接种环分别挑取3种单菌落进行多次平板划线培养，直至获得纯培养物，编号保藏于4 ℃冰箱。观察各菌株的平板菌落特征，以及在显微镜下菌体形态和染色特征。

1.2.4 菌株耐热性分析

以无菌操作挑取菌株，接入LB液体培养基静止培养24 h作种子液，分别取盛有50 mL无菌LB液体培养基的250 mL三角瓶5个，用1 mL无菌吸管分别准确吸取1 mL种子液加入5个三角瓶中，于37 ℃下恒温培养24 h后，放入高压灭菌锅中，分别在100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃、121 ℃温度下处理20 min，然后分别取0.5 mL均匀接种到灭菌后的LB固体培养基中，再放入生化培养箱中，在37 ℃恒温培养24 h，观察菌株生长状况，每组平行3次。

1.2.5 微生物生长曲线测定

以无菌操作分别挑取菌株，接入LB液体培养基静止培养18 h作种子液。分别取盛有50 mL无菌LB液体培养基的250 mL三角瓶16个，分别编号为0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、24 h。用2 mL无菌吸管分别准确吸取2 mL种子液加入已编号的16个三角瓶中，于 37 ℃下振荡培养，分别按对应时间将三角瓶取出，测定OD600值。以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.6 16S rDNA 鉴定

按SK8255试剂盒说明方法进行DNA提取。细菌16S rDNA引物为27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。采用16S rDNA 引物进行PCR 扩增。采用25 μL PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，模板0.5 μL，16S（F）和16S（R）各0.5 μL，加双蒸水补足到25 μL。PCR 循环条件为94 ℃，4 min；20循环（94 ℃，45 s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min），72 ℃ 10 min，4 ℃保温。采用质量分数为1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA 20 min电泳观察。PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（SK8131）说明书的详细步骤进行PCR产物的回收纯化。得到序列信息后登陆美国国家生物技术信息所（national center for biotechnology information，NCBI）页面，利用局部相似性基本查询工具（basic local alignment search tool，BLAST）对比分析所测得的序列和GenBank中现有细菌的16S rDNA序列，挑选相似性序列。

1.2.7 数据分析

利用EXCEL 2016对数据进行统计分析，并绘图。

2 结果与讨论

2.1 热处理后白乌鱼胴体粘液的变化

由于要对鱼体粘液中的杂菌进行热处理去除，所以必须对粘液进行加热。通过不同加热温度处理后的鱼体粘液见图1。图1显示，未加热鱼胴体粘液呈现淡红色，随着加热温度上升，鱼体粘液由淡红色逐渐变为淡绿色。这与我们之前报道的白乌鱼体粘液加热后的颜色变化状况一致[6]。

未加热处理的鱼胴体粘液呈淡红色，这可能是鱼在宰杀去鳞后收集粘液时，带入了一些鱼体血液所致；但是经过不同加热温度处理后的鱼胴体粘液，其颜色由淡红色逐渐变为淡绿色。血液受热通常会变成暗紫色[9]，但是在粘液中的血液受热后却变为淡绿色。这与我们之前的研究现象相同[6]。对引起这一颜色变化的原因还有待进一步研究确定。

图1 热处理后鱼胴体粘液的外表特征Fig.1 Appearance of fish carcass mucus after heat treatment

2.2 热处理粘液中的微生物分析

图2 鱼胴体粘液的耐热性比较Fig.2 Comparison of heat resistance of fish carcass mucus

在对粘液热处理基础上，取0.5 mL粘液，在LB固体培养基中于37 ℃恒温培养24 h，观察微生物的生长状况（见图2）。由图2可知，随着加热温度增加，粘液中的微生物种类呈明显减少趋势。通过比较不同温度下粘液中的微生物种类发现，粘液中主要有3种菌落（命名为 S1、S2、S3），而且在 50 ℃处理粘液的培养基中有S2和S3，而在70 ℃、90 ℃和煮沸粘液的培养基中，只生长了S3，空白组中无菌落生长。

由图2中不同温度处理粘液在培养基上微生物生长状况及空白对照可知，培养基中所生长的菌落并非空气中的杂菌，而是鱼体粘液中自带微生物。由培养基中微生物种类随温度变化情况可知，50 ℃热处理导致S1菌死亡，S2和S3菌能耐50 ℃的高温处理；S3菌最耐热，在煮沸（96 ℃）温度下仍然可以存活，这与我们之前的研究结果相符[6]。

2.3 粘液中3种特征菌的分离及形态学观察

图3 平板划线培养Fig.3 Streak plate culture

为了分析粘液中3种特征菌的生物特性，对3种单菌落经过平板划线进行分离纯化（见图3）。图中的三种微生物形态显示，所分离得到的S1、S2和S3菌株无杂菌污染，分离效果好。通过观察各菌株的平板菌落特征，以及染色后在显微镜下观察菌体形态，发现S1菌株革兰氏染色呈阴性，菌体球杆状，在LB固体培养基上菌落呈微黄色，边缘整齐，表面光滑、湿润；S2 菌株革兰氏染色呈阳性，菌体球状，在LB固体培养基上菌落呈金黄色，边缘不整齐，表面粗糙、湿润有光泽；S3菌株革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，在LB固体培养基上菌落呈白色，边缘不整齐，表面粗糙、不透明。S1、S2和S3菌株特征描述见表1。

2.4 特征菌生长曲线

图4 微生物生长曲线图Fig.4 Microorganism growth curve

为了进一步分析耐热菌的生物特性，对耐 50 ℃以上的菌株S2和S3的生长曲线进行了测定，结果见图4。图4a中数据显示，0～2 h为菌株S2的生长停滞期，细菌数量极少；2 h以后进入对数生长期，菌体数量急剧增多；14 h达到生长最高峰，12～14 h为菌株S2的生长稳定期，菌体生长缓慢；14 h之后细菌数量开始减少，菌株S2进入衰亡期。图4b中数据显示，0～1.5 h为菌株S3的生长停滞期，细菌数量极少；1.5 h以后进入对数生长期，菌体数量急剧增多；16 h达到生长最高峰，12～16 h为菌株S3的生长稳定期，菌体生长缓慢；16 h之后菌株S3进入衰亡期。

由于微生物生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程动态，对于研究微生物生理和工业发酵具有重要指导意义。由图4中菌株S2和S3的生长曲线可知，菌株S2的对数生长期和衰亡期菌落数变化均较菌株S3快速。

表1 特征菌的形态特征Table 1 Morphological characteristics of characteristic bacteria

因此，在菌株S2培养过程中，应严格控制OD600值。根据图4的生长曲线可知，对于菌株S2，采用12～14 h的菌液作为菌种较为合适；对于菌株S3，采用12～16 h的菌液作为菌种较为合适。这个阶段下的菌株，既可以保持高的细胞活力，又可获得多的细胞数。

2.5 菌株S3耐热性比较

图5 不同温度处理下菌株S3耐热性比较Fig.5 Comparison of heat resistance of strain S3 under different temperature treatment

为了进一步分析菌株S3的最高耐热温度，取0.5 mL菌液，分别在100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃和121 ℃处理，然后分别接种到LB固体培养基中，再放入生化培养箱中于37 ℃恒温培养24 h，观察菌株 S3的生长状况（见图 5）。由图可知，100 ℃和105 ℃处理菌液的培养基中生长出了菌株 S3，而110 ℃、115 ℃、121 ℃处理菌液的培养基中无菌落生长。由图5中不同温度处理下菌株S3的生长状况可知，菌株S3是一种能耐受105 ℃高温高压处理20 min的耐热菌，当温度达到110 ℃时，菌株S3不能存活。因此，菌株 S3可作为物化性质类似白乌鱼粘液，且中心温度为105～110 ℃物料杀菌工艺的对象菌（指示菌），以衡量某杀菌工艺是否彻底。同时，图5的杀菌结果显示，白乌鱼体粘液即使在高温煮沸处理下，其中仍有活菌存在。因此，有必要对粘液中的微生物种属进行鉴定，以明确其是否为有害菌。

2.6 粘液中特征菌的种属鉴定

微生物的16S rDNA结构具有保守性，能反应出生物物种的亲缘关系，为生物系统的进化提供线索，也是生物物种的特征核苷酸序列。目前，16S rDNA序列分析已经成为细菌系统分类研究中最有力也是最常用的工具。通过对S1、S2和S3菌的16S rDNA进行PCR扩增，并对所得16S rDNA片段进行电泳分析，所得结果见图6。从电泳结果可知，3种菌株PCR扩增产物的分子量均为1500 bp左右。用PCR引物对PCR产物进行测序。对测序获得的菌株S1、S2和S3的16S rDNA序列，利用NCBI进行BLAST 序列相似性检索，结果见表2。

图6 16S rDNA PCR扩增产物的电泳结果Fig.6 Electrophoretic results of 16S rDNA PCR amplification products

通常在种的分类等级上，若两个分类单位间的16S rDNA序列的同源性高于97.5%，则可把这两个分类单位归于同一个种[10]。根据表2中16S rDNA序列分析结果可知，菌株S1属于不动杆菌属（Acinetobactersp.），与pittii不动杆菌（AcinetobacterpittiiStrain）的一致性为 100%；菌株 S2属于嗜根考克氏菌属（Kocuriarhizophilasp.），与嗜根考克氏菌（KocuriarhizophilaStrain）的一致性为99%；菌株S3属于芽孢杆菌属（Bacillussp.），与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisStrain）的一致性为99%。因此，白乌鱼胴体粘液中的高耐热菌为枯草芽孢杆菌。鉴于枯草芽孢杆菌是需氧菌，少量存在对人体不仅无害，而且还有一定的抑菌效果，而pittii不动杆菌、嗜根考克氏菌具有潜在食品安全风险，所以对于白乌鱼的食用，应高温烹调后再食用较好。

此外，不动杆菌属细菌具有代谢多样性，产生的生物表面活性剂可以降解己内酰胺、除草剂、有机磷农药和多种石油烃组分等，在未来非常有希望应用于石油烃的修复工程[11]。嗜根考克氏菌属是药敏实验的常用靶菌之一[12]，是一种可以产电的微生物，对改善和提高微生物燃料电池（Microbial fuel cells，MFCs）的产电性能具有重要意义[13]。芽孢杆菌属对水产中的有害微生物有很强的抑制作用，在鱼类养殖和鱼类疾病防治方面表现出广阔的应用前景。

表2 16S rDNA鉴定结果Table 2 16S rDNA identification results

3 结论

通过比较热处理后白乌鱼胴体粘液的外表特征，发现新鲜白乌鱼胴体粘液呈淡红色，随着处理温度的升高逐渐呈淡绿色。比较鱼胴体粘液的耐热性，发现接种了 30 ℃热处理粘液的培养基有三种菌落（S1、S2和 S3），接种了 50 ℃热处理粘液的培养基有 S2和S3两种菌，而接种了70 ℃、90 ℃和煮沸处理粘液的培养基，只生长了S3菌，空白组中无菌落生长。比较粘液中3种特征菌的形态特征，发现S1为革兰氏阴性菌，S2和S3为革兰氏染色阳性菌。比较菌株S3的耐热性，发现菌株S3在105 ℃高压灭菌锅中处理20 min之后仍能存活。通过测定菌株S2和S3的生长曲线，发现菌株S2、S3分别在培养14 h、16 h时达到生长高峰。通过16S rDNA序列测序，发现菌株S1属于不动杆菌属（Acinetobactersp.）；菌株S2属于嗜根考克氏菌属（Kocuriarhizophilasp.）；菌株S3 属于芽孢杆菌属（Bacillussp.）。白乌鱼胴体粘液中的高耐热菌为枯草芽孢杆菌。