侧柏叶挥发油的GC-MS分析及抑菌作用研究

周 巍

(信阳农林学院 实验设备管理处，河南 信阳 464000)

侧柏叶为柏科植物侧柏Biota orientalis(L.)Endl的干燥枝梢和叶[1]。侧柏为中国常青植物的代表，广泛分布于全国各地区，如内蒙古南部、广东北部及广西北部等，但在青海、新疆却鲜于见到。常用于治疗吐血、崩漏下血、须发早白等症状[2]。

近年来，从天然植物中提取植物挥发油的报道比较多，但对侧柏叶挥发油相关报道相对较少。又因植物挥发油活性成分对微生物的抑菌作用情况受地区、气候、环境等情况的影响，所以不同地区同种植物挥发油的化学组分有所差异。悉知侧柏研究数据的借鉴意义因地而异[3]。

植物挥发油内含合成香料成分和药用成分，据此可用于人工香料的合成及药品的研发。研究发现其还有抗氧化物质、抗菌物质等成分[4-5]。又因其几乎没有毒副作用，因此挥发油在人类日常生活中得到较为广泛的运用，如食品、化妆品等领域[6-7]。据此，对挥发油的研究、开发利用是开拓未来市场的重中之重。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：侧柏叶，产地信阳，2018年4月采自信阳农林学院羊山校区，经信阳农林学院药用植物教研室鉴定为柏科植物侧柏叶。

试剂：牛肉膏蛋白胨、琼脂、无水乙醚均为国产分析纯

菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella Lignieres)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、苏玉金芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)。

1.2 试验仪器

5000 mL圆底烧瓶，电热套，冷凝装置，Agilent 6850/5975气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，NIST14谱图库，电子分析天平(国产)，培养皿，XFS-40CA电热式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰医疗器械有限公司)，净化工作台(苏净集团安泰公司制造)，DNP-电热恒温培养箱(宁波江南仪器厂)。

1.3 试验方法

1.3.1 侧柏叶挥发油的提取工艺 工艺流程为：侧柏叶破碎→水蒸气蒸馏(冷凝)→分离取上层挥发油。

具体步骤如下：取2000 mL蒸馏水于5000 mL圆底烧瓶中，煮沸，清洗装置中的残留物。向清洗过的烧瓶中预先加入约1000 mL蒸馏水(防止直接加入侧柏叶再加水后加热时造成烧瓶糊底)，再加入适量的侧柏叶，最后再加入适量的蒸馏水(蒸馏水的添加量不超过总容量的3/5)。1-2 h后，挥发油蒸馏完毕，因水油不相容，即可收集蒸馏出的挥发油。

1.3.2 菌种的活化 用电子天平准确称量出牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，葡萄糖1 g于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水加热搅拌使其完全溶解，测量溶解完全并冷却下来的液体培养基的pH值，并用一定浓度的盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节培养基溶液pH值至7～8，将配制完全的液体培养基分别以每支试管10 mL的量分装至7只试管中，捆扎好，在XFS-40CA电热式压力蒸汽灭菌器中，进行温度为121 ℃，时间为30 min的高压蒸汽灭菌。将灭菌后已经冷却的液体培养基放入已经进行过30 min紫外杀菌的净化工作台中，将保藏中的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌分别接种到两支液体培养基中，把接种好的8支培养基放入DNP-电热恒温培养箱进行温度为37 ℃、时间为24 h的恒温培养，使菌种活化。

1.3.3 琼脂培养基的配制 用电子天平准确称量出32 g琼脂于锥形瓶中，并加入1000 mL蒸馏水加热并搅拌溶解，将完全溶解的琼脂培养基包扎好，在XFS-40CA电热式压力蒸汽灭菌器中，进行温度为121 ℃，时间为30 min的高压蒸汽灭菌。

1.3.4 实验用具的准备及灭菌 将抑菌活性试验中将会用到的培养皿、涂布棒、镊子、直径6 mm的圆滤纸片、100 μL移液枪的枪头分别用双层报纸包裹，并用棉线捆扎好后放入XFS-40CA电热式压力蒸汽灭菌器中，进行温度为121 ℃，时间为30 min的高压蒸汽灭菌。

1.3.5 GC-MS分析条件 色谱柱为HP-5 ms毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；程序升温,初始柱温为60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升温速率升至230 ℃，保持1 min；载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min，进样量为1.0 μL，不分流，进样前挥发油用乙醚适当稀释。EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围33～350 amu[8]。

2 结果与分析

2.1 化学成分分析鉴定

在上述条件下，试样经GC-MS联用法分析，所得组分的质谱数据进入NIST14谱图库，经过数据检索及质谱解析并与文献核对，对拟合指标和质谱数据进一步加以确认，确认了14个组分，占总峰面积的83.735%，同时通过面积归一法从总离子流图(图1)中得出侧柏叶挥发油中各化学组分的相对百分含量，分析鉴定结果见表1。

图1 侧柏叶挥发油的总离子流图

序号名称出峰时间占比分子式匹配度分子量1(蒎烯)(1R)-2,6,6-Trimethylbicyclo[3.1.1]hept-2-ene5.30148.713C10H1694136.132(2,2-二甲基-3-亚甲基二环[2.2.1]庚烷)Bicyclo[2.2.1]heptane, 2,2-dimethyl-3-methylene-, (1S)-5.5240.615C10H1697136.133Bicyclo[3.1.0]hexane, 4-methylene-1-(1-methylethyl)---3.096------4Bicyclo[3.1.0]hexane, 4-methylene-1-(1-methylethyl)---2.739------5(月桂烯).beta.-Myrcene6.1515.508C10H1691136.136(α-水芹烯).alpha.-Phellandrene6.4032.007C10H1694136.137Cyclopropane, 1,1-dimethyl-2-(3-methyl-1,3-butadienyl)---1.189------8(α-萜品烯)1,3-Cyclohexadiene, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-6.5980.257C10H1695136.139(双戊烯)Limonene6.8219.282C10H1693136.1310((Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯)1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-, (Z)-7.0660.424C10H1695136.1311(萜品烯).gamma.-Terpinene7.2750.57C10H1695136.1312(萜品油烯)Cyclohexene, 1-methyl-4-(1-methylethylidene)-7.7652.969C10H1697136.1313(4-萜烯醇)Terpinen-4-ol9.1771.19C10H18O94154.1414Acetic acid, 1,7,7-trimethyl-bicyclo[2.2.1]hept-2-yl ester--1.62------15(1-石竹烯)Caryophyllene12.7373.077C15H2499204.1916.gamma.-Elemene--0.294------17(α-石竹烯)Humulene13.1982.014C15H2499204.1918Germacrene D--0.808------19Naphthalene, 1,2,3,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-, (1S-cis)---0.275------20(氧化石竹烯)Caryophyllene oxide15.0070.675C15H24O98220.1821(柏木脑)Cedrol15.4686.434C15H26O95222.2总油量--83.735--

2.2 抑菌试验

采用体外测试体系，接种过程全部在已经进行过30 min紫外杀菌的净化工作台中进行。

将灭菌后的锥形瓶中的琼脂培养基在未凝固前分装至培养皿中，静置等其凝固。将活化好的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌每种菌分别接种到3个培养基上，作平行对照，每个培养基接种100 μL菌悬液，用涂布棒将培养基中的菌悬液涂布均匀，静置30 min后每个接种过的培养基中均匀放入3个浸泡过侧柏叶挥发油的无菌小滤纸片。

将接种完全的培养基放入DNP-电热恒温培养箱进行37 ℃、24 h的恒温培养，观察结果。

大肠杆菌抑菌效果沙门氏菌抑菌效果金黄色葡萄球菌苏云金芽孢杆菌

表2 侧柏叶挥发油抑菌效果

“-”不抑制；“+”抑制，随着“+”增加，抑菌效果增强

3 结论与讨论

在本试验中，利用GC-MS及体外测试体系的方法对信阳农林学院羊山校区侧柏叶挥发油进行了化学成分分析及抑菌试验，结论如下：

从试验中分离出20种成分，其中鉴定出的14种组分均为萜类物质及其衍生物，占精油总量的83.735%。信阳农林学院的侧柏中的挥发油主要的化学成分是：蒎烯(48.713%)，双戊烯(9.282%)，柏木脑(6.434%)，月桂烯(5.508%)等。

回瑞华[9]等在千山侧柏叶挥发油中鉴定出30种化合物，占挥发油总量的98.67%，其主要成分萜类化合物(17个)占挥发油总量的62.99%。由此可知，中药材的效果与其生长环境、地理条件有很大的关系。

很多萜类化合物具有重要的生理活性，是研究天然产物以及开发新药的重要来源。如：蒎烯是药品、化学原料的中间体，其衍生物可作为有用先导化合物进行进一步研究；也是合成香料的重要原料，也可用于日化品以及其它工业品的加香[10]。

从抑菌试验结果看，侧柏叶挥发油对大肠杆菌、沙门氏菌略有抑菌效果，而对金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑制效果。

试验表明，侧柏叶有一定的药用价值，可作为医疗工程及香料工程原料进行开发利用，本研究数据对于该植物开发利用有一定的指导作用。