氟康唑联合盐酸氨溴索对白色念珠菌影响与机制分析

孙相民 高华荣

[摘要] 目的 分析氟康唑聯合盐酸氨溴索对白色念珠菌影响及相关可能机制。 方法 依据药物敏感检测方案，使用微量稀释法来检测盐酸氨溴索与氟康唑单独使用和联合使用对耐药白色念珠菌与敏感白色念珠菌体外抗真菌影响，使用抑菌浓度指数与生长差异百分比模型对两种药物联合抗真菌影响要过进行评价;使用罗丹明6G当做氟康唑荧光代替物，流式细胞仪检测盐酸氨溴索对耐药白色念珠菌的药物转运泵影响情况。 结果 FICI评价联合用药抗白色念珠菌时，对CA8和CA4表征是无关，对CA16和CA10表征为协同;△E评价联合用药抗白色念珠菌时，对CA8和CA4表征是拮抗，对CA16和CA10表征是协同;在Rh6G吸收和Rh6G外排实验实验中，随着时间增加，盐酸氨溴索组荧光强度均高于对照组，且盐酸氨溴索外排量均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 氟康唑联合盐酸氨溴索对抵抗耐药白色念珠菌体外影响显著，其影响机制可能为盐酸氨溴索对抗真菌药物转运泵活性抑制有联系。

[关键词] 耐药白色念珠菌;氟康唑;盐酸氨溴索;协同作用

[中图分类号] R96          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2018）08（c）-0125-03

Effect of Fluconazole and Ambroxol Hydrochloride on Candida Albicans

SUN Xiang-min， GAO Hua-rong

Department of Pharmacy， Peking University Medical Hospital， Zibo， Shandong Province， 255400 China

[Abstract] Objective To analyze the effects of fluconazole and ambroxol hydrochloride on Candida albicans and its possible mechanisms. Methods According to the drug sensitivity testing program， the microdilution method was used to detect the antifungal effects of ambroxol hydrochloride and fluconazole alone and in combination on resistant Candida albicans and Candida albicans in vitro. The antibacterial concentration index was used. The percentage of growth difference model evaluated the effect of the two drugs combined with antifungal; Rhodamine 6G was used as a substitute for fluconazole fluorescence， and the effect of ambroxol hydrochloride on the drug delivery pump of resistant Candida albicans was detected by flow cytometry . Results FICI evaluation of the combination of anti-Candida albicans against CA8 and CA4 characterization is irrelevant， CA16 and CA10 characterization of synergy; △ E evaluation of the combination of anti-Candida albicans against CA8 and CA4 antagonism， CA16 and CA10 characterization was synergistic; in the Rh6G uptake and Rh6G efflux experiments， the fluorescence intensity of the ambroxol hydrochloride group was higher than that of the control group over time， and the abundance of ambroxol hydrochloride was lower than that of the control group， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Fluconazole combined with ambroxol hydrochloride has a significant effect on resistance to Candida albicans in vitro. The mechanism may be related to the inhibition of antifungal drug transport pump activity by ambroxol hydrochloride.

[Key words] Resistance to Candida albicans; Fluconazole; Ambroxol hydrochloride; Synergy effect

近些年来，伴随着器官移植、恶性肿瘤及获得性免疫缺陷综合征患者逐年增多，免疫抑制剂与广谱抗菌药物广泛使用及患者机体内留置导管等技术快速发展，造成临床侵袭性真菌感染对患者发病与死亡率激增，尤其是念珠菌属与曲霉菌属所引发感染[1-4]。因此，该文通过分析氟康唑联合盐酸氨溴索对白色念珠菌影响，为临床真菌感染患者治疗提供一些借鉴。

1  资料与方法

1.1  实验材料

菌株为CA4、CA16、CA10及CA8（该院临床分离菌株），菌株都经过分离纯化，生理生化法鉴别，在﹣70℃冰箱内保存。

1.2  主要试剂与仪器

试剂、药品：磷酸盐缓冲液、盐酸氨溴索、碳酸氢钠、氟康唑、琼脂粉、酵母膏、葡萄糖。仪器：Spectra Max190酶标仪、取菌环、可调式移液器、SC-329常温冰箱、G-560E旋涡混合器、AB-204-N电子天平、超净工作台、手提电热消毒器。

1.3  制备药物母液和培养基

YPD琼脂培养基：8.0 g蛋白胨粉末、8.0 g琼脂粉末、8.0 g葡萄糖粉末和4.0 g固体酵母膏，蒸馏水400 mL，置入500 mL锥形瓶内，加热融合，备用;氟康唑母液：0.064 g氟康唑粉末，放入25 mL瓶内，加水溶解，配制为2560 g/mL浓度氟康唑母液，保存于4℃冰箱内;盐酸氨溴索母液：0.256 g盐酸氨溴索粉末，放入50 mL瓶内，加入溶解，配制为5120 g/mL浓度母液，保存于4℃冰箱内。

1.4  抗真菌作用评测和评价方法

（1）抗真菌评测：微量稀释法;

（2）评价方法：①FICI模型：以LA理论作为基础，使用96孔无菌微孔板，在培养以后，对80%以上真菌生长抑制最低药物的浓度作为MIC，经过部分抑菌浓度指数（FIC）判别互相影响;②△E模型以△E（每孔内真菌的生长率）作为数据、BI理论作为基础综合分析，△E=E1×E2-E联用，E1和E2为两种药物单独使用真菌生长率，E联用是两种药物联合使用真菌生长率。若SYN与ANT加是正值，两种药物有协同影响，加是负值，两种药物有拮抗影响。

1.5  实验方法

①菌株传代：将菌种由冰箱内取出解冻，并接种至TPD琼脂培养基内，35℃养育24 h，选取状态较好菌落再次传菌两次，养育24 h;配置浓度是4.5×106 CFU/mL菌液母液。YPD液体培养基将菌液稀释10倍，培养对数生长期细胞，3 500 rmp离心10 min后采集真菌细胞，PBS洗涤3次，菌液浓度调整成1×107 CFU/mL，摇床内震荡1 h，耗竭细胞能量，用于外排与Rh6G吸收实验。

②氟康唑和盐酸氨溴索分别进行浓度稀释;

③测定Rh6G吸收：药物和Rh6G分别加入到1号管（30LRh6G母液+PBS缓冲液5975l）和2号管（30LRh6G母液+PBS缓冲液59 75L+浓度为5125 g/mL盐酸氨溴索150l），上机检测;

④测定Rh6G外排：采集菌种内加入30LRh6G和无糖PBS59 75l，Rh6G最终浓度是10M;EP管在摇床下震荡培养至Rh6G平衡吸收，然后冰浴10  min。细菌悬液3 500 rmp离心10 min后采集菌细胞，无糖PBS洗涤三次，胞外Rh6G洗掉。

1.6  统计方法

使用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料（x±s）表示，独立样本t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2  结果

2.1  盐酸氨溴索和氟康唑对体外抗白色念珠菌影响状况

FICI评价联合用药抗白色念珠菌时，对CA8和CA4表征是无关，对CA16和CA10表征为协同;△E评价联合用药抗白色念珠菌时，对CA8和CA4表征是拮抗，对CA16和CA10表征是协同，见表1。

2.2  Rh6G外排和吸收受盐酸氨溴索影响状况

在Rh6G吸收和Rh6G外排实验实验中，随着时间增加，盐酸氨溴索组荧光强度均高于对照组，且盐酸氨溴索外排量均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3  讨论

近些年来，白色念珠菌对临床上抗真菌药品都表征出了耐药性，对临床医生和患者治疗一大难题，现在相关研究逐渐倾向于寻求抗真菌药物曾敏机或者新抗菌治疗靶点[5-6]。该文通过对白色念珠菌药敏体外实验研究显示，体外联合使用盐酸氨溴索和氟康唑时，对耐药白色念珠菌发生显著协同影响，说明盐酸氨溴索可在体外使白色念珠菌对于氟康唑的敏感性增大，对目前临床克服白色念珠菌耐药有重大含义。但对盐酸氨溴索与氟康唑协同抵抗白色念珠菌作用机制还需更进一步研究。

药物转运泵表达不正常为白色念珠菌形成耐药性主要机制，药物转运泵过量表达会导致真菌细胞内抗真菌药品浓度降低[7-8]。当前和白色念珠菌耐药性相关药物转运泵有两类，一是ATP能量依赖型的ABC转运蛋白家族，研究比较多的是Cdr2p与Cdrlp功能为把抗真菌药物从细胞内泵出，Cdrp和编码基因CDR与白色念珠菌耐药性有聯系;二是易化扩散载体家族，和白色念珠菌耐药相关的为多药耐药蛋白（Mdrlp），其功能主要为对抗真菌药物吸收产生抑制作用。该文研究显示， 盐酸氨溴索可加速Rh6G吸收同时使Rh6G外排下降，说明盐酸氨溴索可使CA10药物转运泵活性抑制，致使进入细胞氟康唑含量升高，排除量下降，进而使CA10细胞内氟康唑含量升高，逆转CA10耐药性。

综上所述，氟康唑联合盐酸氨溴索对抵抗耐药白色念珠菌体外影响显著，其影响机制可能为盐酸氨溴索对抗真菌药物转运泵活性抑制有联系。

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