烙灸对激素性股骨头坏死骨细胞凋亡与Bcl-2、Caspase-3表达影响的实验研究

朱 宁 ，许建峰 ，2，马 奇 ，陈美华 ，马 川 ，林瑞珠 ，2

（1.宁夏医科大学总医院，宁夏银川750004； 2.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏银川750004）

糖皮质激素滥用导致机体骨组织代谢失衡，股骨头供血失衡致局部缺血坏死、关节面塌陷，甚至导致机体骨折发生的激素性股骨头缺血性坏死（Steroid induced avascular necrosis of the femoral-Head，SANFH）是临床多发病和常见病［1］，占非创伤性股骨头坏死的50%以上，并呈逐年上升趋势［2］，但其确切的发病机制尚未十分清楚［3］。笔者采用特色的回医烙灸疗法治疗SANFH疗效确切［4］，烙灸具有补肾通络、强筋健骨的作用［5］，可有效延缓股骨头缺血坏死骨细胞的凋亡，而骨细胞凋亡和Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达密切相关。因此，本实验通过激素诱导的家兔激素性股骨头坏死模型，观察烙灸疗法对股骨头骨细胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响，为烙灸疗法治疗SANFH提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与仪器 实验用的成年健康家兔24只，体重2.0～3.0 kg，雌雄各半，由宁夏医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK（宁）2015-0013，按照SPF级别标准进行管理。CMIAS病理图像分析系统（北京麦奥迪图像技术有限公司）、光学显微镜（日本Olympus）、DHP-420型电热恒温培养箱（北京永光明医疗仪器厂）。

1.1.2 药品与试剂 SABC免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒、Caspase-3免疫组化试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。氨基甲酸乙酯和4%多聚甲醛固定液购于银川市伟博鑫生物科技有限公司。灸法所用艾绒购于宁夏医药公司（豫郑食药监械［准］字2012第127003号）。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组与造模 将实验动物按随机数字表法随机分为空白组8只，模型组8只和烙灸组8只。全部动物均在同等环境和条件下单笼饲养，适应性喂养动物5 d后，采用常巍等［6］的方法，模型组、烙灸组的16只兔均先按10 μg/kg体质量静脉注射大肠杆菌内毒素2次，2次注射间隔24 h。于第2次注射大肠杆菌内毒素后连续3 d按20 mg/kg体质量间隔24 h肌肉注射甲基强的松龙，每次注射前均需称体重。模型组、烙灸组家兔每只注射青霉素8万U/kg，庆大霉素4万U/kg，2次/w，预防感染。空白组注射等量的生理盐水替代激素。

1.2.2 干预方法 烙灸组：造模4 w后开始行烙灸治疗，一手掌抓握兔子上背部固定兔子，一手持特制的铁器灸具分别放置在兔子的“肾俞”穴和髋关节局部，烙灸铁具灸槽内放置5 g艾绒点燃，每天1次，每个部位约10 min，发热铁器灸具可使局部皮肤发红，治疗4 w后进行取材。模型组和空白组：造模4 w后不予任何干预手段，饲养4 w后进行取材。

1.2.3 实验取材及标本处理 干预4 w后过量麻醉法处死家兔，取髋外侧切口，暴露关节囊内的股骨头，用线锯切取双侧股骨头，沿股骨头负重区冠状面剖开，取软骨下区 1.0 mm×1.5 mm×1.0 mm组织，用10%中性甲醛溶液固定，7%硝酸脱钙，系列酒精脱水，常规石腊包埋、切片备用。

1.2.4 观察指标 形态学观察。软骨下区所取切片浸入二甲苯脱蜡，系列酒精水化，染H（苏木素），水洗，1%盐酸酒精溶液分化，反蓝，水洗，染E（伊红），水洗，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察股骨头组织形态学变化，并任选5个高倍视野，计算空骨陷窝比例并拍片。空骨陷窝与正常陷窝的比值即为空骨陷窝率。

凋亡细胞的检测——TUNEL法［7］。采用原位末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL法），原位细胞凋亡检测试剂盒参照说明书操作。当细胞核出现黄染颗粒为阳性细胞，镜下观察细胞凋亡情况，每张玻片上随机选择5个高倍视野，计算其中骨细胞的总数和TUNEL阳性骨细胞数。细胞凋亡指数（AI）=（TUNEL 阳性骨细胞数/骨细胞数）×100%。

Bcl-2、Caspase-3的检测——免疫组织化学染色（SABC法）。软骨下区所取石蜡切片脱蜡至水；柠檬酸修复液高压修复2～5 min，自然冷却至室温；滴加3%H2O2，室温静置10 min，PBS洗（3 min×3次）；滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体；分别滴加Bcl-2、Caspase-3抗体（1∶100稀释），4℃过夜，PBS洗（3 min×3次）；滴加二抗（生物素化兔抗鼠IgG），室温静置20 min，PBS洗（3 min×3次）；滴加三抗（过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白），室温静置20 min，PBS洗（3 min×3次）；DAB 显色 5～10 min，苏木素复染；脱水、透明、封片、镜检。摄影生物显微镜下观察表达情况，染黄色或棕黄色为阳性，并随机抽取8个40倍显微镜下不重叠视野拍片，使用CMIAS病理图像分析系统，分别测定Bcl-2、Caspase-3在骨细胞中的阳性细胞的灰度值，求出视野表达细胞所占比例。

1.3 统计学方法

所有计量资料采用均数 ±标准差（±s）表示，3组骨细胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白组间比较，采用One-Way ANOVA分析，所得数据使用SPSS18.0 软件包进行统计学分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组家兔股骨头骨组织形态学检查

空白组：可见关节软骨表面光滑，软骨细胞各层次结构清晰；骨小梁排列规则、致密，骨细胞核较大位于中央，于骨小梁中清晰可见，可见少量空骨陷窝；成骨细胞成串排列；骨髓造血细胞丰富；空骨陷窝率（12.58±1.35）%。模型组：软骨表面可见多个裂缝，可见大量脱水固缩坏死的软骨细胞；很多骨细胞细胞核变小，可见骨小梁体积较小，连续性较差，骨小梁断裂明显，骨小梁内出现大量空骨陷窝，空骨陷窝率（32.63±5.12）%。烙灸组：关节软骨表面略粗糙，裂隙表浅；可见少量骨小梁断裂，排列较规则；骨细胞形态基本正常，核清晰可见，位于骨小梁中央；空骨陷窝明显减少，空骨陷窝率（15.21± 2.79）%，接近空白组。结果见图 1。

2.2 各组骨细胞凋亡指数比较

图1 各组家兔股骨头骨组织形态学检查

模型组TUNEL阳性骨细胞数量明显增多，凋亡指数显著高于空白组，2组比较差异有统计学意义（P<0.01）；烙灸组也出现TUNEL阳性骨细胞，但凋亡指数明显低于模型组，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

表1 3组骨细胞凋亡指数比较 （±s）

表1 3组骨细胞凋亡指数比较 （±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P<0.05

组别 n 凋亡指数（%）空白组 8 6.14±0.591）模型组 8 39.83±4.27烙灸组 8 17.25±5.362）

2.3 各组Bcl-2、Caspase-3蛋白检测结果比较

与空白组比较，模型组Bcl-2蛋白表达明显降低，Caspase-3蛋白表达明显升高，2组比较差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，烙灸组Bcl-2蛋白表达升高，Caspase-3蛋白表达降低，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

表2 3组Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的灰度值比较（±s）

表2 3组Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的灰度值比较（±s）

注：与空白组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.05

组别 n Bcl-2 Caspase-3空白组 8 232.68±22.85 150.88±13.78模型组 8 168.09±18.661） 226.69±15.671）烙灸组 8 202.79±24.562） 190.19±15.882）

3 讨论

SANFH是指因大剂量应用激素而造成股骨头内的骨细胞、脂肪细胞和骨髓造血细胞等活性成分死亡所引起的病理过程［8］。激素所致骨及软骨的改变、血液流变学及血管的变化已逐渐被人们所认识，因而，应用有确切疗效的干预方案，提高坏死区域新骨形成及血管再生能力，成为防治SANFH的重点。中医药在股骨头坏死保髋治疗中的作用日益受到重视［9-10］，传统医学中未见股骨头坏死疾病名称的记录，一般将本病归属于“骨痿”“骨痹”等范畴。《素问》提出“虚邪之入于身也深，寒与热相传……病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛……”，指出本病的病邪多为寒邪、湿邪、热邪等，“阴胜则阳病”，阳气受损、致血行瘀滞、瘀阻局部从而出现骨坏死。回医学是中华民族传统医学中的一部分，《回回药方》［5］是具有中国回回特色的医药大型综合性医著，其“针灸门”专论灸，其中以烙灸［11］所占篇幅最长，论述详细，提出“凡一体内多有恶润凝聚以致本体，并其禀气作坏……必以火灸之，则本体病根尽去”。采用烙灸疗法具有温肾散寒、强筋壮骨的功能，不仅能改善SANFH的临床症状［4］，在本课题组的前期研究中，发现其对关节软骨退变具有确切疗效［12-13］，能够延缓骨细胞的凋亡。

细胞凋亡（Appotosis），又称程序化细胞死亡（programmed cell death）［14］，是一种细胞的生理性死亡形式，具有调节表皮、血液、骨等组织细胞数量，维持内环境稳定的作用［15-16］。但细胞凋亡的异常增多或减少会破坏机体的平衡及稳定，从而导致疾病发生。已有文献证实，过多使用激素可导致骨细胞凋亡加速［17］。人体骨细胞是一种比较特别的细胞，自身骨细胞的再生速度没有凋亡速度快则导致骨细胞数量上失衡，不能及时进行力学信号传递及细胞修复工作，导致机体功能紊乱，形成骨坏死甚至股骨头塌陷。本研究发现模型组细胞凋亡增多，与文献报导相符。

参与细胞凋亡调节的内部因子很多，Bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶（Caspase）家族目前受关注最多。Bcl-2做为抗凋亡基因代表成员，是第一个被确认的能对抗细胞凋亡的基因，是细胞凋亡信号转导途径中关键的凋亡调节因子。定位于线粒体外膜上的Bcl-2可能通过抑制谷胱甘肽的外泄，降低氧化还原状态；或者通过介导线粒体外膜通透转运孔孔道复合体的开放，抑制促凋亡蛋白的释放；或通过与胱冬肽酶的间接作用而阻止凋亡进程［18］。因此，细胞凋亡调控与Bcl-2蛋白水平的高低关系密切，Bcl-2增高可抑制细胞凋亡。大剂量激素类药物抑制Bcl-2蛋白的表达，从而增加细胞死亡信号的传输，导致骨细胞凋亡加速［19］。

同时细胞凋亡的发生也是一个由Caspases家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，Caspase是一类存在于胞质中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，通过启动型Caspases的激活，发挥水解蛋白作用，激活下游效应型Caspases，从而影响DNA复制、转录和损伤修复［20］，导致不可逆的细胞死亡。同时Caspase-3作为多种凋亡途径的共同下游效应部分，被活化后的Caspase-3酶解切割DNA依赖的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶等，从而降解细胞内蛋白［21］。依赖cyt-c的释放，Caspase-3可作为Caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者；而Bcl-2家族可通过线粒体途径介导cyt-c等物质释放，Bcl-2不但可作为Caspase-3的上游调控参与对其活性的调节，还可作为Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3的下游，加速凋亡过程［22-23］。

本研究中，糖皮质激素的使用造成股骨头坏死，骨细胞的Bcl-2、Caspase-3蛋白在不同组别出现不同的变化，模型组与空白组比较，Bcl-2蛋白减少、Caspase-3蛋白增加明显（P<0.01），说明激素可诱导成熟的骨细胞凋亡，导致活性骨细胞减少，最终导致骨质疏松甚至股骨头坏死的出现。模型组与烙灸组相比，烙灸组中Bcl-2蛋白的相对表达量高于模型组（P<0.05），说明可能通过烙灸的刺激，阻断细胞传输死亡信号的通路，从而延缓细胞凋亡。与烙灸组比较，模型组的Caspase-3蛋白表达量增高（P<0.05），烙灸组能下调该蛋白表达量，说明烙灸可能通过线粒体途径进行细胞凋亡的调控。

综上所述，激素所致股骨头坏死与骨细胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表达失调相关，而烙灸可以上调骨细胞Bcl-2、下调Caspase-3蛋白表达相对量，提示烙灸可能通过线粒体途径进行细胞凋亡的调控来达到防治股骨头坏死的目的。