文冠果种子蛋白质提取及组分分析

宋宏新，刘 娟，薛海燕

( 陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

文冠果(Xanthocerassorbifolia)属无患子科、落叶灌木或小乔木，是中国北方特有的珍稀木本油料植物果实[1]。由于其花美果丰，抗旱耐寒，在美化乡村、治理荒山和水土保持工程中意义重大，因此被大量种植。文冠果种仁蛋白质含量丰富，脂肪含量约55%～60%，多糖2%～3%，其油脂含90%以上的不饱和脂肪酸[2-4]，且含有多种中药配方中的皂苷及活性化合物[5]，已有用于食用及轻化工产品的开发研究[6]。植物蛋白是素食者重要的蛋白来源[7-8]，营养与动物蛋白相仿，但更易于人体消化。文冠果种子压榨油脂后剩余的种粕中富含蛋白质，其所含氨基酸种类齐全，且经动物试验研究表明，文冠果仁中蛋白质利用率接近酪蛋白，超过经特殊加工的浓缩大豆蛋白和葵籽蛋白[3,9]。但由于文冠果种子的基础研究资料相对缺乏，食用历史较短，作为新资源食品暂未获得国家许可。近年来，中国文冠果育林及产果量持续增加，对文冠果油脂的加工利用研究也相应增多，主要作为生物柴油与高级食用油进行开发[10]，也有将其叶进行加工作为凉茶的开发利用[11]，而对文冠果中的蛋白质研究较少。因此，为充分利用文冠果种子资源，实现其高附加值的加工利用，为相关产品的开发奠定基础，对其种子蛋白质进行系统的基础分析研究十分必要。

以大豆为代表的植物种子大多以碱溶酸沉法提取分离种子蛋白质，文冠果也有如此的提取研究，但对文冠果种子蛋白质的系统研究分析报道甚少，有关其种子蛋白质的组分及亚基种类与构成资料缺乏。本研究采用溶剂浸提法对文冠果种子中的主要蛋白组分进行提取定量及电泳定性分析，旨在为文冠果种子蛋白提取工艺的优化奠定基础，为文冠果资源的充分开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

文冠果购于陕西文冠果实业集团有限公司(产于陕西淳化)，去除果壳后，将种子冷藏备用。

试剂：NaOH、石油醚(30～60 ℃)、乙醇、NaCl(均为分析纯)；N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(美国Sigma公司)；Tris-base、甘氨酸(美国Amresco公司)；SDS(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)；N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(美国Amersham公司)；β-巯基乙醇(上海源叶生物科技有限公司)；考马斯亮蓝R-250(加拿大Bio Basic公司)。

1.2 仪 器

真空冷冻干燥机(DZF-6020 上海一恒科学仪器有限公司)；集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S 巩义市予华仪器有限责任公司)；自动凯氏定氮仪(KN520 济南阿尔瓦仪器有限公司)；石墨消解仪(SH220 济南海能仪器股份有限公司)；水浴振荡器(HZS-HA 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；高速冷冻离心机(HC-3018R 安徽中科中佳科学仪器有限公司)；凝胶成像分析系统(GIS400 南京驰顺科技有限公司)。

1.3 文冠果种子蛋白的提取

1.3.1 文冠果种子蛋白组分的提取 采用连续分级提取法[12]提取文冠果种子蛋白组分。原料的脱脂处理：文冠果种子经人工去壳，粉碎后，采用石油醚进行脱脂处理，按料液比(1∶10)加入石油醚(沸程：30～60 ℃)，采用超声波清洗器超声20 min，于5 000 r/min离心5 min，重复2次，将沉淀置于通风橱直至溶剂挥发完全，得到文冠果种子脱脂粉，4 ℃下密封冷藏。

采用4种溶剂(H2O、φ=10%NaCl、φ=75%乙醇及φ=0.2%NaOH)依次连续分级提取蛋白质，根据各蛋白组分在不同溶剂中的溶解性差异进行分级提取，分析文冠果种子蛋白组分构成。

清蛋白的提取：准确称取脱脂粉1.50 g，放入50 mL离心管中，加入20 mLH2O，置摇床上震荡2 h，于4 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集上清液作为一次提取样待测。再向沉淀中加入10 mL H2O提取，震荡，离心，收集上清液，合并两次上清液作为2次提取样待测。重复第2次的步骤，合并3次上清液作为3次提取样待测。

球蛋白的提取：向提取清蛋白后的沉淀中加入φ=10%NaCl，3次提取步骤及溶剂用量同清蛋白提取操作，分别得到球蛋白3次提取液样待测。

向提取球蛋白后的沉淀中加入φ=75%乙醇，向提取醇溶蛋白后的沉淀中加入φ=0.2%NaOH，同上操作，分别得到醇溶蛋白和谷蛋白提取液样待测。

1.3.2 一次直接提取法提取文冠果种子蛋白 采用一次直接提取法提取蛋白[13]：准确称取脱脂粉1.50 g，分别采用4种溶剂(H2O、φ=10%NaCl、φ=75%乙醇及φ=0.2%NaOH)作为溶剂浸提剂，研究单一溶解对4种蛋白的一次性直接提取。提取操作程序同连续分级提取法中清蛋白的提取步骤，分别得到水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白和碱溶蛋白的3个不同体积的提取液，-20 ℃下保存，备用。依据公式(1)计算蛋白提取率。

蛋白提取率=提取液中的蛋白量/总蛋白量×100%

(1)

1.3.3 碱溶酸沉法提取文冠果种子蛋白 碱溶酸沉法提取蛋白[14]：准确称取5.00 g脱脂粉与55 mL超纯水混合，用1 mol/L的NaOH溶液调节pH至11.0，在41 ℃下恒温磁力搅拌浸提30 min，离心20 min，得到蛋白提取液，重复以上步骤，合并2次提取液(剩余残渣冷冻干燥后待测)，用1 mol/L的HCl溶液调至pH 4.6，离心(收集上清液，待测)；加入适量超纯水将沉淀溶解，再用1 mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，进行冷冻干燥后即得蛋白粉，称量后低温保存。

将提取过程中各保留样品用凯氏定氮法测定蛋白含量，并依据公式(2)计算蛋白得率。

蛋白得率=(蛋白粉质量×蛋白粉纯度)/脱脂粉质量×100%

(2)

1.4 文冠果种子蛋白的定量和定性分析

1.4.1 凯氏定氮定量分析 采用凯氏定氮仪分别对各蛋白组分提取液进行蛋白质量分数测定[15]，蛋白质转化系数取6.25。

1.4.2 SDS-PAGE电泳定性分析 电泳样品制备：分别量取连续分级提取出的4种蛋白组分提取液，以1∶1的体积比加入2×SDS样品缓冲液(含巯基乙醇)，其中蛋白粉和脱脂粉样品加入适量的样品缓冲液调整其蛋白质量浓度至10 mg/mL，摇匀，100 ℃煮沸5 min，于3 000 r/min离心5 min，点样[16]。

电泳条件：凝胶电泳的分离胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度为5%[17]，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、蛋白粉、脱脂粉的点样量分别为13、12、15、12、8、8 μL。

在恒定电流30 mA条件下进行电泳，考马斯亮蓝G-250进行染色，脱色液进行脱色。之后用凝胶成像仪进行图像扫描，并分析电泳结果。

2 结果与分析

2.1 文冠果种子粗蛋白质量分数

根据凯氏定氮法测定去壳后的文冠果种子中粗蛋白质量分数为26.29%±0.05%，采用索氏抽提法测得种子中粗脂肪质量分数为57.67%±0.02%，经脱脂后测得脱脂粉中粗蛋白质量分数为62.04%±0.01%。结果显示，文冠果种子中富含脂肪和蛋白质，脱脂粉中的蛋白质量分数高，文冠果种子目前主要开发利用脂肪，然而，脱脂后的剩余籽粕可作为优质蛋白资源进行开发。

2.2 文冠果种子蛋白定量分析

2.2.1 连续分级提取法提取文冠果种蛋白组分 以文冠果种子脱脂粉为提取原料，采用4种提取剂依次连续分级提取蛋白质，4种蛋白组分的3个不同体积提取液进行蛋白定量测定，计算脱脂粉中的各蛋白组分含量，结果如图1所示。

图1 连续分级提取蛋白组分质量分数Fig.1 Protein component mass fraction by sequential extraction

由图1可知，3个提取阶段中4种蛋白组分的蛋白含量均呈现出依次增加的趋势，但在第3次的提取中蛋白增加量变少，因此确定提取次数为3次。经测定，分级提取法提取得出文冠果种子脱脂粉中各蛋白组分的质量分数由大到小依次为：球蛋白26.38%、清蛋白21.50%、谷蛋白2.49%、醇溶蛋白1.99%。通过计算得出采用溶剂分级提取法提取出的蛋白组分总量为52.36%，即提取率为84.40%，说明该方法能完整的分离出各主要蛋白组分。对各类不同溶解性蛋白的组成比例进行分析，表明文冠果种子蛋白具有较好的水溶性，为其进一步高效率的提取与加工工艺提供良好的参考依据。

2.2.2 一次直接提取法提取文冠果种子蛋白 采用4种提取剂一次性直接对脱脂粉进行提取，4种提取液得到的3个不同体积样品的蛋白质定量，计算提取蛋白质在脱脂粉中质量分数，结果见图2，计算提取率(提取蛋白质占总蛋白质的比率)，结果见表2。

图2 一次直接提取蛋白质量分数Fig.2 Protein component mass fraction by direct extraction

由图2可知，一次直接提取法提取得出文冠果种子中的碱溶蛋白含量最多，而醇溶蛋白含量最少。4种蛋白在3次提取中均呈现蛋白含量递增的趋势，第3次提取结果增加的趋势平缓，因此确定提取次数为3次。经测定，一次直接提取法提取得出文冠果种子脱脂粉中各蛋白的提取量(以1.00 g 脱脂粉为提取原料计算)及提取率由大到小依次为：碱溶蛋白0.496 9 g和80.09%、盐溶蛋白0.468 8 g和75.57%、水溶蛋白0.214 8 g和34.63%、醇溶蛋白0.045 0 g和7.26%。由此得出采用碱溶液提取蛋白的提取率最高，可提取80%以上的蛋白质。

对以上2种提取方法进行比较得出，一次直接提取法得出的盐溶蛋白含量相较分级提取出的球蛋白质量分数高，是由于其中包含了部分水溶蛋白；而碱溶蛋白与分级提取出的谷蛋白结果相比质量分数较高，是由于碱溶液提取过程中包含了部分清蛋白与球蛋白。分级提取法能有效的将4种蛋白组分分离，为进一步辨别及定性分析各蛋白组分奠定基础；而一次直接提取法的结果表明利用碱性溶剂提取文冠果种子蛋白更为高效，为文冠果蛋白的提取加工提供了科学依据。

2.2.3 碱溶酸沉法提取文冠果种子蛋白 以文冠果种子脱脂粉为原料，采用碱溶酸沉法提取蛋白，经真空冷冻干燥后，依据凯氏定氮法对该试验提取过程中各部分蛋白质量分数进行定量测定，经测定得出提取液中的蛋白质量为0.521 5±0.000 6 g，依据公式(1)计算可得，采用碱溶酸沉法提取文冠果种蛋白的提取率为84.06%，较一次直接提取法中的蛋白提取率高。

通过进一步对碱溶酸沉法得到的提取残渣、沉淀后上清液和蛋白质粉进行定量计算(表1)，该方法得到沉淀干燥蛋白粉的纯度为83.92%，由公式(2)计算出蛋白得率为36.40%，其结果与孔维宝等[18]采用单因素试验和正交试验优化研究结果相当。

表1 碱溶酸沉法各步骤样品蛋白质定量结果Table 1 Quantitative results of protein in each step by alkali-solution and acid-isolation extraction

通过表1计算提取过程3个样品蛋白质总量，与实际测得总蛋白质量分数为62.04%的结果相符，该法得到了种子中58.70%的蛋白质，残渣剩余蛋白质占比为12.90%，提取液未沉淀(上清液)蛋白质占比为28.40%。由结果可知，要提高蛋白得率，对碱液提取工艺进行优化，应在研究蛋白质特性表征基础上，优化酸沉条件，从而达到减少损失的目的。

2.3 文冠果种子蛋白SDS-PAGE分析

对试验中文冠果种子蛋白质5个样品、脱脂粉及蛋白Maker的SDS-PAGE分析结果如图3所示。

根据选用的蛋白Maker(分子质量依次为：118、90、50、34、26、19 ku)电泳后的迁移率及其分子量确定出标准曲线，再根据图谱中蛋白迁移率计算出图谱中各蛋白的主要亚基分子质量。并使用Image J软件分析电泳图谱中的蛋白条带灰度值，计算其相对质量分数，结果见表2。

a.清蛋白 Albumin；b.球蛋白 Globulin；c.醇溶蛋白 Gliadin；d.谷蛋白 Glutenin；e.蛋白粉 Protein powder；f.脱脂粉 DefattedXanthocerasseeds；g.Maker

图3 文冠果种子蛋白的SDS-PAGE电泳图谱Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of Xanthoceras seeds protein

理论上种子脱脂粉包含了文冠果种子全部的蛋白质(简称总蛋白)，图3的电泳图谱显示，该泳道(f)电泳条带最多，可以鉴定为10个，各亚基分子质量及相对质量分数如表2所示，其亚基分子质量分布于20～60 ku，包含3个主条带，其分子质量分别为25.76、38.05和56.76 ku。

对比4种蛋白组分与脱脂粉的电泳图谱可得，其中清蛋白(泳道a)的条带显示最多，且分布广，包含7个条带，2条主带的分子质量分别为25.76和38.05 ku，表明文冠果种中的蛋白质具有较好的水溶性。球蛋白(泳道b)含4个条带，其中38.05和56.76 ku为高含量亚基。谷蛋白(泳道d)含3个条带，两条主带为25.76 ku和38.05 ku。而醇溶蛋白(泳道c)由于蛋白质量分数低，条带模糊，仅有18.74 ku明显可见。通过比较分析可以看出相对分子质量为38.05 ku的蛋白亚基在4种提取溶剂中均呈现出较高的溶解度，表明该蛋白亚基质量分数较多；相对分子质量为25.76 ku的蛋白亚基在水溶液以及碱溶液中的溶解度较高。

碱溶酸沉得到的蛋白粉包含了文冠果种子绝大部分的蛋白质，蛋白粉(泳道e)电泳可鉴定8个条带的亚基分子质量及相对质量分数如表2所示，其中2个主条带的分子量分别为38.05和56.76 ku。与总蛋白进行对比可以看出，碱溶酸沉法提取出的蛋白中分子质量为25.76 ku的蛋白亚基质量分数较少，而该亚基却显示为谷蛋白中的一条主带，可能是由于提取液的浓度或酸沉不充分导致。由此可得，为保证提取蛋白的完整性，应进一步优化碱溶酸沉法提取蛋白过程中的提取条件。

3 结 论

采用连续分级提取法分离得出文冠果种子脱脂粉中球蛋白及清蛋白质量分数较多，一次直接提取法得出采用碱溶液可高效提取文冠果种蛋白，碱溶酸沉法的蛋白提取率可达84.06%，并得到纯度为83.92%的蛋白粉。对比直接浸提法与碱溶酸沉法的蛋白提取率，表明碱溶酸沉法提取蛋白的提取效率高，操作条件易于控制，便于工业化放大生产文冠果种蛋白粉。通过SDS-PAGE电泳对提取出的蛋白分析得出文冠果种子蛋白质包含有10种亚基，其中质量分数较大的亚基分子质量为：56.76、38.05和25.76 ku。有关文冠果种子蛋白质的营养安全与加工工艺特性还有待深入研究。然而，文冠果作为一种亟待开发的优质蛋白源，对其种子蛋白组分及溶解提取特性的研究，为实现对其高效的工业化提取蛋白，并进一步应用于食品行业提供了基础。