新疆天池放线菌的分离及其抑菌活性

王秀爽，田江丽，邵胜楠，崔志浩，潘崇乐，张国强

(1.石河子大学 农学院，新疆石河子 832003；2.石河子大学 生命科学学院，新疆石河子 832003)

放线菌是一类极具开发价值的微生物，它不仅能够产生多种抗生素[1]，还能代谢产生极具商用价值的多糖或蛋白质类物质[2]，其中不乏一些具有农用开发价值的生物活性物质。因此，放线菌资源的挖掘一直是各国学者关注的焦点。植物病害严重威胁着中国农业生产，以放线菌为基础开发微生物源农药既可在一定程度上挽回病害损失，还能降低对环境的污染。中国新疆地域广阔，拥有多种特殊的自然环境，蕴藏着丰富的微生物资源。因此，深入挖掘新疆微生物资源，开发具有新疆特色的微生物源农药，对中国植保领域的发展具有重要意义。近年来国内外多家科研单位对新疆放线菌资源开展深入挖掘工作，主要对罗布泊、艾比湖、于田盐池、哈密盐湖等干旱或高盐环境中的放线菌进行研究[3-8]，发现大量放线菌新种，如Streptomycesluteus、Nocardiopsisakesuensis、Saccharothrixlopnurensis、Glycomycesxinjiangensis等[9-12]。然而，对于这些新疆特色放线菌的农用活性研究相对较少，加之国内外对新疆放线菌资源的挖掘主要集中在南疆的荒漠和盐湖地区，对天山天池地区放线菌资源的农用活性研究则更为稀少。因此，有必要开展新疆天池放线菌资源挖掘及农用活性研究。本研究对天池地区土壤样品中的放线菌进行选择性分离，结合离体和活体试验筛选对植物病原菌具有抑制作用的放线菌，并进行初步分类鉴定，以期获得具有研究与开发价值的资源放线菌，为开发新疆特色微生物源农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品 采自新疆天池地区(海拔1 900 m 左右，88.12～88.15°N，43.85～43.92°E，采集时间为2016年12月)的12份土壤样品，按照土壤类型混合为4种土样，分别为砂土、壤土、草甸土以及河底泥土，阴干，备用。

1.1.2 分离及纯化培养基 GA培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.05 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH为7.4～7.6。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH为7.4～7.6。

NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH为7.4～7.6。

TPA培养基：海藻糖5 g，脯氨酸1 g，(NH4)2SO41 g，NaCl 1 g，CaCl22 g，K2HPO41 g，ZnSO4·7H2O 1 g，硫胺素50 μg，核黄素50 μg，烟酸50 μg，泛酸钙50 μg，维生素B650 μg，肌醇50 μg，对-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH为7.2。

HVA培养基：腐殖酸1 g，CaCO30.02 g，Na2HPO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KCl 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，硫胺素50 μg，核黄素50 μg，烟酸50 μg，泛酸钙50 μg，维生素B650 μg，肌醇50 μg，对-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，琼脂18 g，蒸馏水1 L，pH为7.4。

CA培养基：几丁质4 g，K2HPO40.5 g，FeSO4·7H2O 1 mg，琼脂20 g，硫胺素50 μg，核黄素50 μg，烟酸50 μg，泛酸钙50 μg，维生素B650 μg，肌醇50 μg，对-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，蒸馏水1 L，pH为7.4。

GB培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.05 g，蒸馏水1 L，pH为7.4～7.6。

1.1.3 抑制剂 放线菌酮和萘啶酸均为分析纯试剂。

1.1.4 供试病原菌 立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、番茄灰霉病原菌(Botrytiscinerea)，由石河子大学农学院植物病理实验室提供。

1.1.5 供试种子 黄瓜种子(‘荷兰35’，感病品种)，由新疆建设兵团第十师北屯市农科所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 土样采集方法 在每个采样地区选取多个采样点，采用蛇形采样法进行取样，土层深度为0～5 cm。取样品200～500 g采用四分法进行混合。将所采土样装入布袋或聚乙烯塑料袋，内外均应附标签，标明采样编号、名称、采样深度、采样地点、日期、采集人等信息。

1.2.2 土样中微生物含量测定方法 称取0.5 g风干土样，用无菌水系列稀释至10-4，取100 μL分别按照以下方式处理：细菌在28～30 ℃条件下用NA培养基恒温培养，放线菌用GA培养基培养，真菌用PDA培养基培养，采用平板计数法统计每克干土中细菌、放线菌和真菌的个数。

1.2.3 土壤放线菌分离方法 将供试土样风干磨碎过200目筛后，采用3种方法进行处理：(1)称取0.5 g风干土样，置于10 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)中30 ℃处理60 min，1 500 g离心20 min，然后静置10 min，取上清液系列稀释至10-4后取100 μL涂于分离培养基平板上分别于4 ℃和22 ℃培养15～30 d，挑出放线菌后于GA培养基中纯化培养。(2)称取0.5 g风干土样，置于1.5%苯酚(5 mmol/L磷酸缓冲液pH=7.0配置)中30 ℃处理20 min 后取上清液系列稀释至10-4，取100 μL涂于分离培养基平板上培养15～30 d，挑出放线菌后于GA培养基中纯化培养。(3)称取0.5 g风干土样，用无菌水悬浮后，系列稀释至10-4，取100 μL涂于分离培养基平板上培养15～30 d，挑出放线菌后于GA培养基中纯化培养。所有分离培养基内均含有50 mg/L放线菌酮和50 mg/L萘啶酸。

1.2.4 放线菌发酵液制备 将放线菌接种于GA培养基平板上，27 ℃培养5～7 d，取8个6 cm菌饼接种至GB液体培养基(100 mL)中，28 ℃、160 r/min摇床培养5～7 d，取上清过0.45 μm 无菌滤膜后备用。

1.2.5 抑菌活性测定 对峙法：在培养皿上穿过中心作一条线，将放线菌接种于线上1/3处，28 ℃培养2～3 d至完全定殖后，将病原真菌菌块接种至放线菌菌落对称位置，继续培养3～5 d 后，测量放线菌菌落之间的真菌菌落宽度。

牛津杯法：在GA培养基平板表面直接对称放置2个牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。在杯中加入200 μL发酵液无菌滤液，在2个牛津杯中间接种病原真菌，28 ℃培养3 d后测量抑菌圈直径。

盆栽法：取籽粒饱满的黄瓜种子在φ=75%乙醇中表面消毒3 min，用无菌水清洗3次，然后放于铺有湿润滤纸的培养皿中，置于30 ℃条件下催芽48 h。试验使用的土壤中含有立枯病菌1.5 g/kg。试验时将10粒黄瓜种子浅播于花盆中，并加入20mL放线菌菌株发酵液。设无菌水为对照，每个处理重复3次。每隔3 d加1次发酵液，培养9 d时检查植株发病率、株高以及发芽率。

1.2.6 放线菌鉴定 形态学鉴定：采用插片法[13]在GA培养基平板上培养放线菌3～5 d后，在400倍电子显微镜下观察菌丝及孢子丝形态，然后利用鉴定手册进行分类鉴定[14]。

放线菌菌株在GB液体培养基中培养24 h后，用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(全式金，中国)进行放线菌基因组DNA提取；使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG- ACTT5-3′)，结合EasyTaqPCR SuperMix(全式金，中国)进行16S rDNA进行扩增；PCR反应程序为： 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，循环30次，72 ℃再延伸10 min。反应结束后进行电泳检测， PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行纯化与测序。测序结果进行BLAST，选取相似度较高的菌株序列，利用MEGA7.0进行系统发育树构建(使用NJ法建树，Bootstrap法进行1 000次重复，利用Kimura 2-parameter法计算进化距离)。

1.2.7 数据统计分析 采用SPSS19软件对数据进行统计分析，采用Duncun’s新复极差法对数据进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 天池地区不同类型土壤中的微生物含量差异

新疆天池地区的4类土壤样品中含有大量微生物，包括真菌、细菌和放线菌。从表1可看出，4种土壤样品中细菌含量最高，其次为放线菌，真菌最少。其中草甸土中放线菌数量最多，为1.58×108CFU/g。而砂土中的放线菌数量最少，为2.67×107CFU/g。

表1 天池地区不同类型土壤微生物含量Table 1 Microbial content in differentsoil types of Tianchi

2.2 天池放线菌的分离与纯化

采用2种预处理方法和3种分离培养基对供试的4类土壤样品中放线菌进行选择性分离，共分离得到213株放线菌。从表2可以看出，草甸土样品中分离得到的放线菌数量最多，壤土次之，两者得到的放线菌数量分别为86株和79株，占放线菌分离总数的40.38%和37.09%。

表2 各土样中放线菌的分离情况Table 2 Data of actino mycetei solation from soil samples

2.3 天池放线菌的抑菌活性

采用菌株对峙法测定213株放线菌对立枯丝核菌和番茄灰霉病菌的拮抗作用，结果发现有14株放线菌对立枯丝核菌的拮抗效果在70%以上(表3)，8株放线菌对番茄灰霉病菌的拮抗效果在60%以上(表4)。其中有5株放线菌(TC-33、TC-50、TC-52、TC-95和TC-174)对立枯丝核菌和番茄灰霉病菌均具有抑制作用。

表3 14株放线菌对立枯丝核菌的抑制效果(对峙法)Table 3 Inhibition of 14 strains against R.solani(Antagonistic method)

注：数据后标有不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Note：Values followed by the different letters in the same column are significantly different(P<0.05).The same below.

表4 8株放线菌对番茄灰霉病菌的抑制效果(对峙法)Table 4 Inhibition of eight strains against B.cinerea(Antagonistic method)

利用牛津杯法对5株放线菌的菌株代谢物的抑菌活性进行测定，结果显示该5株放线菌的代谢物对立枯丝核菌和番茄灰霉病菌均具有较强的抑制作用(表5)，说明抑菌活性物质主要为胞外代谢产物。

利用盆栽法测定5株放线菌对黄瓜立枯病的防治效果，结果显示放线菌TC-33、TC-50和TC-95的菌株代谢物对黄瓜立枯病均具有较好的防治效果(图1-A)，其中TC-50菌株代谢物的防效最高，为89.98%。在试验中发现TC-50发酵液可促进黄瓜幼苗生长(图1-B)，而TC-95发酵液对黄瓜幼苗生长具有一定的抑制作用。3株放线菌的代谢物均可提高黄瓜种子在含菌土壤中的发芽率，尤其是TC-50，其菌株发酵液可使种子发芽率提高90%以上(图1-C)。

表5 5株放线菌发酵液对2种病原菌的 抑制作用(牛津杯法)Table 5 Inhibition of five strain’s metabolites against two pathogenic fungi (Oxford-cup method)

2.4 放线菌TC-50初步鉴定

经过形态学观察，放线菌TC-50菌落为灰白色、干燥、绒状、无色素产生(图2-A)，气生菌丝丰富，孢子丝为直线形，孢子呈椭圆形(图2-B)，属于灰白色放线菌类群；利用分子手段对放线菌TC-50进行分子鉴定，结果显示TC-50与StreptomyceschumphonensisKK1-2(NR_126175)亲缘关系最近(84%)，其序列相似达98%(图3)，结合形态学分析，最终确定放线菌TC-50归属于链霉菌(Streptomycessp.)。

A.菌株代谢物对黄瓜立枯病的防治效果 Effects of strain’s metabolites againstRhizoctoniarot；B.菌株代谢物对黄瓜幼苗株高的影响 Effects of strain’s metabolites on plant height of cucumber；C.菌株代谢物对黄瓜种子发芽及生长的影响 Effects of strain’s metabolites on germination and growth of cucumber seeds；D.对照 Control

图13株放线菌菌株代谢物对黄瓜立枯病的防治效果及对黄瓜幼苗生长的影响
Fig.1Effectsofthreestrain’smetabolitesonRhizoctoniarotandseedlinggrowthofcucumber

图2 放线菌TC-50菌落(A)及孢子丝形态(B)Fig.2 Colony (A) and sporotrichial (B) of strain TC-50

图3 基于16S rDNA序列分析的放线菌TC-50系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain TC-50 based on the sequence analysis of 16S rDNA

3 讨 论

新疆地域广阔，拥有多种特殊的自然环境，造就了该地区独特的微生物资源及其特殊的代谢物。天山天池位于新疆塔里木盆地和准噶尔盆地天然分界线上，海拔1 928 m，年均气温2.5 ℃，冬季长期处于-15 ℃以下。本研究从该地区获得213株放线菌，其中有24株耐4 ℃低温的放线菌。可见，该地区的耐低温放线菌较为丰富。另外，本研究发现草甸土中的放线菌数量(1.58×108CFU/g)显著高于其他类型土壤中的放线菌。从王启兰等[15]的研究可见，青藏高原地区多种草甸土中平均放线菌数量显著低于本研究结果，仅为5.676×104CFU/g，但是获得的低温放线菌数量占比较高，为32.35%，其原因可能是青藏高原地区海拔较高，气温较低，更适合低温放线菌的生长。

本研究以立枯丝核菌和番茄灰霉病菌为指示菌株，对213株放线菌进行抑菌活性筛选，发现17株放线菌具有一定抑菌活性，占比8.0%。笔者曾对青藏高原地区放线菌进行抑菌活性筛选，在279株放线菌中发现28株具有抑菌活性的放线菌(组织法活性测定结果大于60%)，占比10%[16]，这与本研究结果有一定差异，主要原因在于土样来源的不同、供试病原菌差异及生物活性测定方法的不同。因此，对于天池放线菌的生物活性需要深入研究，可针对抑菌、杀虫、除草、诱抗活性等方面进行广泛筛选。

分子鉴定结果显示，菌株TC-50与S.chumphonensis最近缘。S.chumphonensis最早是在海洋沉积物中分离得到的，它的气生菌丝为白色至黄白色，能产生长链状的非移动性孢子[17]，而且至今仍未有文献报道该菌株具有抑菌活性，由此可见菌株TC-50与S.chumphonensis存在较大差异。后期将采用细胞壁成分分析、DNA杂交等技术进一步探究两者之间的关系，并明确菌株TC-50的准确分类地位。