甘肃旱地春小麦及部分重要骨干亲本麦谷蛋白亚基组成分析

陈 琛,王 炜,袁俊秀,陈 军,牟丽明

(1.甘肃省农业科学院 生物技术研究所，兰州 730070；2.甘肃省农业科学院 小麦研究所， 兰州 730070；3.定西市农业科学研究院，甘肃定西 743000)

旱地小麦是甘肃省小麦的主体，约占全省小麦种植面积的75%左右[1]，主要分布在庆阳、平凉、天水、陇南4个地区[2]。提高产量一直是小麦遗传改良的主要目标。近年来，甘肃省在“稳面积提单产”的策略下，小麦单产水平已获得很大程度的提升[3]。随着经济的发展和生活水平提高，市场对小麦品质，尤其是加工品质的要求愈高。小麦加工品质逐步成为育种的重要目标[4]。

小麦麦谷蛋白亚基组成和含量与小麦加工品质密切相关。麦谷蛋白在还原状态下，根据SDS-PAGE中迁移率的不同又分为高分子质量麦谷蛋白亚基 (HMW-GS)和低分子质量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)两类[5]。HMW-GS由位于第一同源组群的1A、1B和1D 染色体长臂近着丝点处的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点的基因编码[6]，研究认为HMW-GS主要影响面团的弹性；而LMW-GS则由位于第一同源组群染色体短臂的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点的基因编码[7]，对小麦弹性及品质具有重要作用[8]。由于LMW-GS 变异丰富，鉴定方法困难，国内外对LMW-GS研究程度远不如HMW-GS。直到Wang等[9-10]开发了7个和10个用于鉴定Glu-A3和Glu-B3位点等位基因的STS标记，并进行了验证，才使低分子质量亚基能够被相对准确地检测并用于育种工作。Glu-1和Glu-3位点对和面特性存在加性和互作效应，应综合考虑HMW-GS和LMW-GS 对小麦加工品质的影响，才能准确评价LMW-GS等位变异对小麦品质的效应[11-12]。

有关甘肃小麦品种HMW-GS组成的研究表明，甘肃小麦与国内主产区小麦品种在品质上有较大差异[1]。如李望鸿等[13]对甘肃小麦地方品种和早期甘肃主栽品种HMW-GS组成进行分析，结论是甘肃小麦优质亚基的频率较低，小麦加工品质普遍低劣。但上述研究所选样本及研究年代都较为久远，近年来有关甘肃主栽小麦麦谷蛋白亚基组成及分布的研究非常少见。有关小麦麦谷蛋白的研究和报道也多集中在高分子质量麦谷蛋白亚基，而关于LMW-GS的研究也比较少。因此，本研究针对已开发可用于育种的高、低分子质量麦谷蛋白亚基功能标记，选取公认的优质亚基AxNull、Dx5、Bx7、By8和Bx14 5个高分子质量麦谷蛋白亚基和 Glu-A3d、Glu-B3b 2个低分子质量麦谷蛋白亚基，对甘肃近年育成的旱地春小麦品种(系)及部分重要骨干亲本共82份材料进行分子标记检测，明确这些材料中优质HMW-GS和LMW-GS分布及组成情况，旨在了解和掌握甘肃近年来育成旱地春小麦品种(系)的品质改良效应，为甘肃小麦品质改良工作提供材料和参考信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘肃省旱地春小麦品种(系)及部分重要骨干亲本共82份，主要来自陇东、河西和中部麦区3个旱作地区主栽春小麦品种(系)，由甘肃省农业科学院生物技术研究所、小麦研究所、旱地农业研究所，定西市农业科学研究院等单位提供。其中育成品种(系)65份，包括‘定西16号’‘定西17号’‘定西18号’等16个定西系列旱地小麦品种，‘会宁3号’‘会宁12号’‘会宁13号’‘会宁15号’4个会宁系列旱地品种，‘陇春27’‘陇春35’‘陇春40’‘岷春4号’‘岷春20号’‘岷春21号’以及旱地春小麦品系‘节水1233’‘节水8028’‘节水9701’‘节水9809’等。引进品种(系)12份，包括引自青海省的‘高原356’‘高原448’‘高原465’，引自黑龙江省的‘垦红14’‘垦红19’‘龙麦29’‘龙麦30’等。农家品种5份。

1.2 试验步骤

基因组DNA提取：选取每份材料饱满种子若干粒，室温下在培养皿内发芽，待幼苗长度约 5 cm 时，根据Edwards等[14]报道的CTAB法提取小麦基因组DNA，用于基因位点检测。 PCR反应和电泳：特异性分子标记的引物序列、大小及相关信息见表1。

表1 分子标记PCR引物序列Table 1 The sequences and amplification fragments sizes of HMW-GS primers

PCR反应体系15 μL，包括2×TaqMasterMix 7.5 μL(中科瑞泰北京生物科技有限公司)，标记基因上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL(上海生工生物工程股份有限公司)，模板DNA 50 ng，用ddH2O补充反应体系至15 μL。Dx5、Bx7、By8的PCR扩增程序参照芦静等[20]的方法进行，AxNull的扩增程序参照Lafiandra等[15]的方法，Bx14的扩增程序参照王欣等[19]的方法， Glu-A3d和Glu-B3b的扩增程序参照Kolster等[11]的方法。扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶中加入EB染色。缓冲体系为1×TAE溶液，120V电压电泳30 min，此后用紫外成像系统扫描成像并进行分析。

2 结果与分析

2.1 甘肃旱地春小麦品种(系)及部分重要骨干亲本HMW-GS分子检测

电泳结果如图1，在Glu-A1位点，35份材料扩增出920 bp的DNA条带(图1-A)，说明含有Null，由于Glu-A1位点通常只编码3种亚基，即Ax1、Ax2*和AxNull[15]，因此，含有Ax1/Ax2* 的材料有47份，分布频率为57.3%；Glu-B1位点的亚基以7+8为主，共有59份材料同时扩增出630/766 bp和527 bp的DNA片段(图1-C、1-D)，分布频率为72.0%；在‘定西17’‘定西19’等4份材料扩增出407 bp的DNA条带，说明含有稀有亚基Bx14(图1-E)，分布频率为4.9%。其中在‘定西18’‘岷春21’‘甘春21’和‘西旱1号’等15份材料中检测到了稀有亚基7，在‘大红芒’‘节水1233’这2个品种中检测到稀有亚基8，分布频率分别为18.3%和2.4%。在Glu-D1位点，26份材料扩增出450 bp的DNA条带(图1-B)，说明含有Dx5，分布频率为31.7%。

Marker DL2000；A. Null亚基(920 bp) Subunit Null (920 bp)；B. Dx5亚基(450 bp) Subunit Dx5(450 bp)；C. Bx7亚基(630/766 bp) Subunit Bx7(630/766 bp)；D. By8亚基(527 bp) Subunit By8(527 bp)；E. Bx14亚基(407 bp) Subunit Bx14(407 bp)

图1部分材料HMW-GS的PCR产物电泳图
Fig.1ElectrophoresisofPCRamplifiedfragmentsofHMW-GS

由表2可知，Glu-A1位点的Ax1/2*在育成品种中频率为61.5%，高于引进品种近1倍。7+8亚基在育成品种和引进品种的频率依次是73.8%和66.7%，为Glu-B1位点的优势亚基。这个比例在定西系列育成品种中高达81%，会宁系列品种中高达100%。稀有亚基7在育成品种和引进品种分别占16.9%和25.0%。而品质较好的14+15分别只占4.6%和8.3%。稀有亚基8在1份育成品种中检测到，引进品种中没有发现。Glu-D1位点的5+10亚基在育成品种中的频率是30.8%，低于引进品种近20%。

表2 不同来源的甘肃主栽旱地春小麦HMW-GS分布频率Table 2 Frequencies of HMW-GS glutenin subunits in spring wheat varieties cultivated in Gansu province

组合方式上，2个位点具有优质亚基的组合以(Ax1/2*，7+8)组合为主，共29份材料检出，频率为35.4%。其中育成品种、引进品种频率分别是40%、8.3%。其次是(Ax1/2*，5+10)组合共19份材料，频率为23.2%，育成品种和引进品种分别占24.6%和25%，农家品种中没有这种组合。15份材料中检测出(7+8，5+10)组合，频率是18.3%，育成品种、引进品种的频率分别是18.5%和25%，农家品种中也没有检测出这种组合。3个位点都具优质亚基的材料有11份，其中(Ax1/2*，7+8，5+10)组合10份，9份为育成品种(系)，1份为引进品种。(Ax1/2*，14+15，5+10)组合仅有1份(表3)。

表3 Glu-1 3个位点具优质亚基的小麦品种(系)Table 3 Wheat varieties(lines) with three good quality subunits located at Glu-1 locus

2.2 甘肃旱地春小麦品种(系)及部分重要骨干亲本LMW-GS分子检测

由表4可知，在Glu-A3位点，66份材料扩增出967 bp的DNA片段， Glu-A3d以 80.5%的频率成为Glu-A3位点的优势亚基(图2-A)。76.9%的育成品种含有 Glu-A3d亚基，供此次试验所用的引进品种100%具有 Glu-A3d亚基。在Glu-B3位点，35份材料扩增出1 570 bp的DNA片段，说明具有Glu-B3b亚基，分布频率为42.7%(图2-B)。41.5%的育成品种和58.3%的引进品种具有Glu-B3b亚基。( Glu-A3d，Glu-B3b)组合在供试材料中所占比例为37.8%。He等[21]研究指出，对面团的延展性作用，Glu-B3d和Glu-B3b等位基因比其他的等位基因大。对中国干白面条的品质来说， Glu-A3d 和 Glu-B3d较其他等位基因稍大[22]。从试验结果看出，育成品种的LMW-GS略低于引进品种，但总体来说，甘肃旱地春小麦及部分重要骨干亲本在LMW-GS上占有较大优势。

表4 不同来源的甘肃主栽旱地春小麦LMW-GS分布频率Table 4 Frequencies of LMW-GS glutenin subunits in spring wheat varieties cultivated in Gansu province

Marker DL2000；A. Glu-A3d亚基(967 bp) Subunit Glu-A3d(967 bp)；B. Glu-B3b亚基(1 570 bp) Subunit Glu-B3b(1 570 bp)

图2部分材料LMW-GS的PCR产物电泳图
Fig.2ElectrophoresisofPCRamplifiedfragmentsofLMW-GS

2.3 HMW-GS与LMW-GS在供试材料中的组合分布

将HMW和 LMW麦谷蛋白亚基组合方式进行分析，结果表明供试的82份小麦品种(系)中在3个位点含优质亚基的组合以(Ax1/2*、7+8、 Glu-A3d)为主，所占比例为29.3%。在4个位点含优质亚基的组合以(5+10、7+8、 Glu-A3d、Glu-B3b)和(Ax1/2*、5+10、7+8、 Glu-A3d)为主，比例分别为8.3%、6.1%。在5个位点含优质亚基的材料有8份，组合类型有(Ax1/2*、5+10、7+8、 Glu-A3d、Glu-B3b)、(Null、5+10、7+8、 Glu-A3d、Glu-B3b)和(Ax1/2*、5+10、14+15、 Glu-A3d、Glu-B3b)3种，分别在4份、3份、1份材料中检测出。

2.4 经典品种的亚基组成

由表5可知，本研究的供试材料主要为甘肃近年育成的旱地春小麦品种(系)及部分重要骨干亲本，其中有一些经典品种如‘陇辐2号’‘西旱1号’‘陇春27号’‘定西38号’以及引进的‘龙麦30’‘垦红14’‘高原356’，都是公认的优良抗旱品种，在育种工作中常被选作亲本。因此，明确经典品种的麦谷蛋白亚基组成十分必要。

表5 经典品种的亚基组成Table 5 Composition of high quality subunits in classic varieties

3 讨 论

前人研究麦谷蛋白的方法多为SDS-PAGE，该方法一般以成熟籽粒或面粉为样品，检测成本较高，工作量大，并且很难准确区分分子质量相近的亚基。本研究所用的分子标记法在成本和工作量上相较于SDS-PAGE法都大大减少，利用引物的特异性，仅根据PCR产物电泳条带的有无就能判断相应亚基，鉴定结果比蛋白质电泳结果更为准确直观。

和以往研究相比，甘肃近年主栽春小麦的优质麦谷蛋白亚基已有了明显提升。就5+10亚基来说，李望鸿等[13]在2010年对甘肃部分春小麦研究表明，优质亚基5+10的频率分别为9.0%；叶春雷等[23]在2012年对甘肃省春小麦育成品种研究表明5+10的频率略有升高，为10.7%。此次研究中5+10亚基的频率为31.7%，明显高于早期品种。

Payne等[7]研究认为，不同位点编码的 HMW-GS对小麦品质的效应不同。本试验选取的5个HMW-GS是根据高翔[24]对不同亚基对小麦品质影响大小研究结果，选取了Glu-Al 位点的1/2*，Glu-Bl 位点的14+15和7+8，Glu-Dl 位点的5+10几个公认的优质亚基。另外，Payne等[25]在1983年的研究表明，HMW-GS 3个位点对小麦品质的影响具有加性效应，毛沛等[26]对1 600余份国内小麦研究结果也证实了这一点，即对于小麦品种来讲，它含有的 HMW-GS 数目越多，它的品质就越好。从本研究的结果来看，甘肃近年育成旱地春小麦及部分重要骨干亲本在单个亚基的分布频率都较高，但亚基组合的频率偏低，这也是导致甘肃小麦加工品质不高的一个原因。

目前，国内外关于LMW-GS的研究还远不如对HMW-GS的研究。事实上，LMW-GS约占整个种子贮藏蛋白的1/3，占麦谷蛋白的60%，对小麦品质性状有重要影响。因此，仅以HMW-GS评价小麦品质是片面且不够准确的。朱金宝等[27]研究表明，小麦加工品质的好坏既受HMW-GS的影响，也与LMW-GS有关，两者之间相互作用共同影响着小麦的品质。与以往单纯以HMW-GS评价小麦相比，本试验将LMW-GS与HMW-GS综合研究，试验中选取的2个LMW-GS分别是 Glu-A3d和Glu-B3b，也是经前人研究得出的优质亚基。结果表明甘肃省主栽旱地小麦的 Glu-A3d和Glu-B3b比例分别是80.5%和42.7%。可见，在LMW-GS单个亚基上，甘肃旱地春小麦占有较高的比例，这种优势在育种工作中应当予以保留和利用，但是LMW-GS与HMW-GS的组合频率远低于单个亚基的频率。导致这种结果的因素有很多，其中一个原因可能是多年来甘肃小麦育种只注重产量的提高而忽视品质的改善，即使在品质改良中，也较多注重 HMW-GS的研究而忽略了LMW-GS对品质的重要影响，鲜有综合评价LMW-GS与HMW-GS的研究。本研究不仅鉴定HMW-GS的分布情况，而且对LMW-GS的分布频率也进行研究鉴定，加强甘肃小麦育种工作中的这一薄弱点，对小麦品质改良提供了新的育种信息。此次研究中筛选出8份在5个位点具优质亚基的材料，这些材料在以后的育种工作中将得到充分利用。

4 结 论

本研究采用STS分子标记的方法，对82份甘肃主栽旱地春小麦品种(系)及部分重要骨干亲本进行了检测分析，明确了HMW-GS与LMW-GS优质亚基分布频率。甘肃近年主栽旱地春小麦单个优质亚基的分布频率与早期甘肃春小麦品种相比有了明显提升，尤其在LMW-GS具有较大优势。但亚基组合的频率偏低且种类较单一，导致甘肃小麦的加工品质还是不高。在今后的小麦品质育种工作中还需加强对现有优势的利用和存在问题的解决。