miRNA-1和miRNA-133过表达对诱导性多能干细胞心肌分化的影响

王芳芳 白宝宝 曾 迪 楚 轶 李 雪

中国人民解放军空军军医大学第二附属医院心内科，陕西西安 710038

目前，心血管疾病，尤其是心肌缺血所导致的大量功能性心肌细胞死亡、损伤等，已成为威胁人类健康的首要杀手[1-3]。研究显示，自我更新和多向分化的干细胞能够分化再生成心肌细胞，这为心血管疾病的治疗带来了新的希望[4-7]。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），可从自体细胞逆分化获得，在避免伦理学争议的同时也解决了免疫排斥反应等难题[8-10]。然而，iPSC定向诱导分化目前还存在着靶细胞定向分化效率不高、分化机制尚未明确、靶细胞功能未趋向成熟等问题，阻碍了其在心肌组织工程再生中的应用。

microRNA（miRNA）是广泛存在于真核细胞内的一类内源性非编码小RNA，可调节mRNA的翻译，但不负责编码蛋白质，其序列高度保守，生物功能较广。其通过降解mRNA抑制蛋白质翻译表达，进而调控细胞的生长、分化、迁移、凋亡及组织发育。大量实验表明，已有40余种miRNA参与调控心肌生理和病理活动，其中miRNA-1和miRNA-133已被证实参与了胚胎期心肌生成及发育过程，且在肌组织中表达丰富。本研究旨在为进一步研究miRNA-1和miRNA-133在调控iPSC定向分化为心肌细胞过程中的作用，为促使iPSC更有效地向心肌细胞定向分化提供更为可靠的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

美国国家癌症研究所（ICR）孕鼠来源自解放军空军军医大学第二附属医院动物中心，2周龄，10只，体重 9～12 g，合格证号 SCXK（陕）2017-0002，使用许可证号20170611。适应性饲养条件：配置好饲料、饮水、垫料，做好通风，12 h/12 h明暗交替，温度26℃，湿度50%～70%。iPSC购自中科院实验中心；miRNA-mimic、miRNA-1mimic、miRNA-133amimic购自德国 miScript；所有细胞培养基及血清均购自Invitrogen公司。OpenArray®实时荧光定量PCR、Invitrogen E-Gel Imager凝胶成像系统购自法国Vilber Lourmat；CKX41倒置相差显微镜及显微照相系统均购自奥林巴斯公司。本研究已得到医院医学伦理委员会同意及动物伦理批准。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞的前期培养 取2周龄ICR孕鼠胚胎，加入含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶（0.5 g/L）进行消化接种，传代3代后利用丝裂霉素处理，冻存备用。

1.2.2 小鼠诱导性多能干细胞（miPSC）的培养 复苏冻存的miPSC，并接种于丝裂霉素处理后的胚胎成纤维细胞上，接种密度为0.5×106个/皿，37℃孵育。观察细胞的生长情况，定期更换培养液。将来源于胚胎成纤维细胞上的miPSC进行消化传代，种于8.7 μg/cm2Matrigel覆盖的培养皿内，培养2 d，除去饲养层细胞；再次消化，以2×106个/mL的密度重悬于iPSC培养基，种于1 g/L明胶覆盖的培养皿内，37℃孵育至细胞铺满培养皿80%的范围；更换培养基为miPSC分化培养基。

1.2.3 miPSC的miRNA转染及分化效率的检测 利用LipofectamineTM2000方法，在利用分化培养基培养的miPSC细胞中分别加入对照miRNA（U6）（记为对照组）、miRNA-1（10 nmol/L，记为 miRNA-1 组）、miRNA-133（10 nmol/L，记为 miRNA-133组）及 miRNA-1和miRNA-133（分别为 10 nmol/L，记为 miRNA-1+133 组），转染24 h后PBS洗涤，观察每日miPSC的分化情况，采用CKX41倒置相差显微镜10倍观察miPSC形态学特征，捕获出现跳动的心肌合胞体的数量，计算细胞博动率并以细胞搏动率评判分化效率，两者趋势一致。细胞搏动率（%）=搏动群落数/细胞群落总数×100%，重复3次，取平均值

1.2.4 RT-PCR检测miPSC的miRNA-1、miRNA-133及心肌肌钙蛋白（cTnT）表达 收集miPSC细胞，提取总 RNA，以总体积 20 μL、RNA 样品 1 μg的体系，反转录合成cDNA（参照试剂盒进行），利用RT-PCR测定 miRNA-1、miRNA-133和 cTnT的表达。RTPCR 反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，PCR上下游引物各 1.0 μL，cDNA 模板 2.0 μL，ddH2O 6.2 μL。引物序列：cTnT的正向引物序列为5′-CAGAGGAGGC CAACGTAGAAG-3′，反向引物序列为 5′-TCGATCAGAGTCTGTAGCTCATT-3′；GADPH的正向引物序列为 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCT-3′，反向引物序列为5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAG-3′；miRNA-1 的正向引物序列为 5′-TACACCATGGCAACGTAGAAT-3′，反向引物序列为 5′-ATGTGGTACCGTCGCATCTTA-3′；miRNA-133的正向引物序列为5′-CACCAGACCAGAGGCAGATG-3′，反向引物序列为5′-GTGGTCTGGTCTCCGTCTAC-3′；miRNA（U6）的正向引物序列为 5′-CACAGGATTCCGGCGTGGAG-3′，反向引物序列为 5′-GTGTCCTAAGGCCGCACCTC-3′。显示的结果为与miRNA（U6）相比的相对值（以 2-ΔΔCt法进行计算分析）。PCR引物序列由赫澎（上海）生物科技有限公司提供。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行数据处理，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miPSC形态学特征

miPSC细胞形态为呈集落突起状的卵/椭圆形，集落边缘光滑，细胞排列紧密，增殖较快，倍增时间较短。随着细胞的不断分化及陆续平铺，聚集成团，团块边缘衍生出梭形或多边形细胞，并交织成网，形成细胞团/细胞簇。见图1。

图1 光学显微镜下miPSC形态学特征（10×）

2.2 各组miRNA-1、miRNA-133转染效率比较

与对照组比较，miRNA-1组及miRNA-1+133组的 miRNA-1相对表达量升高，miRNA-133组及miRNA-1+133组的miRNA-133相对表达量升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图2 各组miRNA-1、miRNA-133转染效率比较（n=3）

2.3 不同分化时间下cTnT在miPSC中的相对表达量变化

未分化的miPSC中较少表达cTnT，与分化0 d时比较，分化5 d后miRNA-1组及miRNA-133组内cTnT的表达明显升高（P＜0.05），而在分化10 d时升高更明显（P ＜ 0.01）。分化 10 d时，miRNA-1+133组 cTnT表达水平较miRNA-1组及miRNA-133组更高（P＜0.01）。 见图 3。

2.4 过表达miRNA-1和miRNA-133对miPSC分化效率的影响

图3 不同分化时间下cTnT在miPSC中的相对表达量变化（n=3）

与对照组比较，miRNA-1组及miRNA-133组细胞搏动率无变化（P＞0.05），miRNA-1+133组搏动率显著提高（P＜0.01）。见图4。

3 讨论

miRNA作为一类非编码的短链RNA，长度为18～22 nt，能够结合基因的3′UTR来进行靶基因mRNA的翻译调控[11-13]。资料显示，许多miRNA在心肌细胞分化、心脏发育等过程中发挥重要的调节功能，miRNA-1、miRNA-133尤甚，其在肌肉组织中的表达具有高丰度特点，在心脏发育、心律失常、心肌肥厚等心脏生理病理过程中发挥作用，且miRNA-1和miRNA-133作为关键调节因子参与干细胞分化形成心肌的过程[14-17]。miRNA-1和miRNA-133隶属同一基因簇，在受血清应答因子、成肌分化因子等调控特异miRNAs的过程中均有表达且可以同时被转录，但miRNA-1和miRNA-133功能截然不同，前者是加速成肌细胞分化，抑制其增殖；后者相反，两者平衡存在。

图4 过表达miRNA-1和miRNA-133对miPSC分化效率的影响（n=3）

iPSC具有强大的增殖能力及分化能力，利用iPSC技术可获得患者或者疾病所需的特异多能干细胞，减少免疫排斥反应[18]。但目前iPSC在心肌定向分化、心肌再生领域中的研究尚不成熟[19-21]。本研究结果显示，未分化的miPSC较少表达cTnT，分化5 d后miRNA-1组及miRNA-133组内cTnT的表达明显升高，而在分化10 d时升高更明显，且miRNA-1+133组中cTnT表达水平较miRNA-1组及miRNA-133组更高；另外，单独过表达miRNA-1和miRNA-133，细胞分化效率及细胞搏动率未见增长；但过表达miRNA-1+133后，搏动率显著提高，提示二者可能在促进miPSC向心肌分化的过程中存在协同作用，可能与二者同时过表达后诱导分化形成的心肌细胞骨架更明显、形态更伸展、细胞结构更成熟、分化效率更高等有关。Takaya 等[22]提出，miRNA-1、miRNA-133 参 与 胚 胎细胞二维分化，与本研究观点有所不同，原因可能是本研究采用的是成纤维细胞，具体机制还需进一步探讨。

综上所述，miRNA-1与miRNA-133单独作用对心肌分化无促进作用，但共表达miRNA-1和miRNA-133后，可显著提高miPSCs向心肌细胞定向分化的效率，这一过程可能是通过协同作用来完成的。本研究为揭示miPSCs分化过程中miRNA-1和miRNA-133的协同分子机制研究提供了实验基础。