补阳还五汤中黄芪药材的煎煮动力学模型的建立

梁顺光 王圣鑫 王利胜

1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006；2.广东省监狱中心医院药械科，广东广州 510430

补阳还五汤全方由黄芪、当归尾、赤芍、川芎、红花、桃仁、地龙7味中药组成，出自《医林改错》，是清代名医王清任创立的益气活血名方，主治半身不遂、言语不利、口眼歪斜等症状。本方重用黄芪峻补元气，少佐活血化瘀之品，诸药合用，使气旺血行、瘀祛络通[1]。

黄芪，为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[2]。 黄芪作为补阳还五汤的君药，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效，其中黄芪中的黄芪甲苷主要起补气养血作用[3-5]，毛蕊异黄酮葡萄糖苷主要起保护神经的作用[6-8]。现今对于黄芪的研究主要集中于单味药、药对、复方中剂量以及煎煮方式器具，对于黄芪在补阳还五汤中煎煮动力学的研究几乎没有，本研究拟对黄芪主要有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷在补阳还五汤中进行煎煮动力学的研究。

本研究对补阳还五汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的煎煮动力学进行研究，建立煎煮动力学模型，以Fick扩散定律为基础，推算出方程参数，将测定结果代入数学模型进行方程拟合。为定量研究中药复方煎煮动力学规律奠定理论和实验基础，为补阳还五汤生产提取和中成药研制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 药物与试剂

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：170105002）；黄芪、当归尾、川芎、赤芍、红花、桃仁、地龙均购于广州清平中药材市场，经广州中医药大学中药学院张丹雁教授鉴定为正品，饮片性状均符合2015版《中国药典》。甲醇、乙腈为色谱纯；超纯水为实验室自制；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

戴安U-3000高效液相色谱系统（美国Thermo Scientific公司）包括U3000四元梯度泵、ASI-100自动进样器、DAD-3000检测器、变色龙色谱工作站；RE-2000型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂）；SKM型数字显恒温电热套（山东甄城光明仪器有限公司）；AUW120D十万分之一电子天平（日本岛津公司）。

2 方法与结果

2.1 黄芪应用于补阳还五汤中煎煮有效成分的含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脱，程序见表 1；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；进样量；10 μL[9-12]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷在此流动相下色谱峰明显且无杂质峰，见图1~3。

表1 洗脱程序

图1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品色谱图

图2 补阳还五汤样品色谱图

图3 补阳还五汤阴性（缺黄芪）色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，置于10 mL量瓶中加甲醇至刻度线，充分摇匀，制成0.05 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 补阳还五汤样品溶液的制备

取1份补阳还五汤处方量（黄芪60 g、当归尾9 g、川芎 6 g、赤芍 9 g、红花 9 g、桃仁 9 g、地龙 9 g）置于三口圆底烧瓶中，浸泡30 min，用8倍量水（pH 8.2）提取 1 h，于（沸腾后开始计时）0、5、10、15、20、30、40、50、60 min吸取3 mL药液并补足重量，吸取出的药液加无水乙醇至体积分数达70%，搅拌，放置至无沉淀物生成，抽滤，滤液回收乙醇，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.1.4 线性关系考察

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品0.50 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品储备液。分别吸取上述毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品储备液0.25、0.50、0.75、1.00、1.20、1.50 mL，分别置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品梯度溶液。分别精密量取上述毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品梯度溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积值。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归。毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程：y=35.95x-0.3605，R2=0.9999，结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量与峰面积在2.50～15.00 μg之间线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，重复测定6次，分别测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷。各色谱峰相对峰面积的RSD为1.07%，说明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

精密吸取补阳还五汤药液1 mL，摇匀，按含量测定项下供试品溶液的制备和测定法操作，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，测定补阳还五汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积。各色谱峰相对峰面积的RSD为2.34%，说明补阳还五汤样品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验

精密吸取同一批补阳还五汤样品溶液6份，各1 mL，按含量测定项下供试品溶液的制备和测定法操作，测定补阳还五汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积。各色谱峰相对峰面积的RSD为1.33%，说明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收试验

精密称取已知补阳还五汤样品溶液1 mL，共6份，精密加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷、对照品按供试品制备方法制成供试液，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。毛蕊异黄酮葡萄糖苷的加样回收率为101.15%，RSD为2.27%，说明该方法可用于毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定。结果见表2。

表2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷加样回收结果

2.2 补阳还五汤中黄芪药材煎煮药动学模型研究

2.2.1 煎煮药动学的模型建立

根据查阅的文献，以及Fick扩散定律及希格比传质穿透模型理论，推导出总方程[13-15]：

其中CB为溶液浓度，M为溶剂倍量，R为药材充分吸收吸湿所需水体积与干的药材质量之比，σ1为药材颗粒粒度，t为时间，n与扩散系数有关。

若只改变煎煮时间，对（1-1）取对数可得公式（1-2）：

若只改变溶剂倍量，对（1-1）取对数可得公式（1-3）：

根据以上公式，通过合理地试验设计，就可以初步建立补阳还五汤煎煮动力学模型。

2.2.2 补阳还五汤煎煮提取实验

2.2.2.1 黄芪干药材吸溶剂率的测定 分别取2、4、6、8、10、12 g黄芪，与同比例其他6味药材，置于500 mL圆底烧瓶中，加入8倍量水，煎煮1 h，滤过称重，结果见表 3，取平均值，R=3.25[16-22]。

表3 黄芪药材干湿比

2.2.2.2 f1和σ1的测定根据“2.1.1”项下条件，对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量进行测定，结果含量为0.25%确定f1为0.5783；采用均匀取样的方法取黄芪20 g，分别测量其边长，求均值，最终确定σ1为 2.10 cm。

2.2.2.3 提取时间对提取率的影响 采用上述建立的高效液相色谱法进行含量测定，结果见表4。通过试验数据做lnCB-lnt线性回归，考察煎煮出的毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度是否遵守（1-2）式，结果见图4。由图4可知，当M=8 mL/g时，线性回归方程y=0.3692x-1.8699，R2=0.9795，根据方程，将相应数值联立可求得溶剂倍量为8 mL/g时，n=-0.3542，α=1.3706。

2.2.2.4 溶剂倍量对提取率的影响 采用上述建立的高效液相色谱法进行含量测定，对不同溶剂量提取的处方固定在30 min定点取样，结果见表5。通过试验数据做lnCB-lnt线性回归，考察煎煮出的毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度是否遵守（1-3）式，结果见图5。由图5可知，t=30 min时，线性回归方程y=0.9375x-6.4555，R2=0.9152，根据方程，将相应数值联立可求得提取时间为30 min时，n=0.8564，α=0.8679。

表4 不同时间补阳还五汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量

图4 时间因素回归方程

表5 不同溶剂倍量补阳还五汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量

图 5 lnt-ln（M-R）考察因素

2.2.2.5 方程的建立 根据上述实验推断出煎煮药动学方程为

2.2.3 模型的验证

根据所建立的动力学方程式，可以计算出不同提取时间下补阳还五汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的浓度，计算结果见表6。

表6 模型的验证结果（mg/mL）

以上检验数据表明，本研究所建立的动力学模型能较好地与试验结果相吻合，各条件下的试验数值与计算数值的标准偏差（0.3013%）基本能满足工业标准偏差要求（<10%）。

3 讨论

结果表明，补阳还五汤中黄芪药材毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法稳定可行。推导出的提取动力学模型对补阳还五汤煎煮过程也有很好的适用性，但有一定的适用范围，超过该范围后预测误差就会偏大。并且从lnCB-lnt图中可以看出，补阳还五汤中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量随着时间的增长而增加，所以实际煎煮过程中直接将黄芪浸泡后煎煮是符合本煎煮动力学模型的。实验计算值与测量值有一定的误差，可能是σ1、R测量误差与仪器误差造成的，有文献将σ1并入α中从而减少误差[23-24]，该模型的建立对于补阳还五汤的生产工艺考察具有一定指导意义。

国内对于单味药物煎煮动力学模型的建立研究比较多见，主要有以Fick扩散定律为基础推算的煎煮动力学模型和计算K、α、β、AUC等动力学参数的煎煮动力学模型[25]。补阳还五汤中黄芪药材煎煮动力学模型的建立，能为补阳还五汤煎煮时间、煎煮方式优化改良及补阳还五汤中成药的研制提供指导，可以阐明补阳还五汤中各药物有效成分煎煮动力学间的差异，为研究补阳还五汤的配伍、补阳还五汤煎煮动力学以及相关的煎煮动力学研究奠定理论和实验基础。

本研究首次对复方中一味药物进行煎煮动力学模型的建立，研究所建立的动力学模型能较好地与试验结果相吻合，但是也只考虑了煎煮一次时的情况以及溶剂倍量、温度不变的情况，这是本研究的局限性，今后应该将多次提取、溶剂倍量、温度因素结合到模型中，完善模型，最终用于指导补阳还五汤的工业生产。