调经赞育丸抑制催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的作用研究

王婧婧 王 张

1.成都市第七人民医院妇产科，四川成都 610021；2.成都中医药大学民族医药学院，四川成都 611137

调经赞育丸由人参、韭菜子、当归、蛇床子、益母草、川芎、薏苡仁、蟾酥等组成，具有补益肾气、调经赞育等功能，临床上主要用于女性肾阳虚损、月经紊乱、痛经、性欲减退、功能性不孕症等症，属于虚实夹杂、以虚为主的病证。针对肾的阴阳亏虚，应阴阳双补[1]，正如张景岳《景岳全书》曰：“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷；善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭。”方中人参、韭菜子补益肾气，助肾阳，共为君药；当归、益母草、川芎活血调经，兼补气血，为臣；蛇床子、薏苡仁、蟾酥以通络，为佐使之剂。全方共奏补益肾气、调经赞育之功。孙嘉敏等[2]研究了调经赞育丸对雄激素致不孕大鼠生育功能的治疗作用及其机制，结果提示调经赞育丸能明显增加大鼠卵巢中各级卵泡总数和黄体数，能明显恢复大鼠的动情周期和排卵功能，降低大鼠血清中的总睾丸酮含量，还能明显升高大鼠血清中雌二醇和卵泡刺激素含量。

痛经为最常见的妇科症状之一，指行经前后或月经期出现下腹部疼痛、坠胀，伴有腰酸或其他不适，严重影响生活质量。痛经分为原发性和继发性两类，原发性痛经指生殖器官无器质性病变的痛经；继发性痛经指由盆腔器质性疾病，如子宫内膜异位症、子宫腺肌病等引起的痛经。原发性痛经的发生主要与月经时子宫内膜前列腺素含量增高有关。前列腺素F2α（PGF2α）含量升高是造成痛经的主要原因[3]。 PGF2α含量高可引起子宫平滑肌过强收缩，血管痉挛，造成子宫缺血、乏氧状态而出现痛经[4]。张丽梅等[5]观察了调经赞育丸对痛经的治疗作用，发现其能延长催产素、PGF2α所致小鼠痛经扭体潜伏时间，减少痛经扭体反应次数。但是，调经赞育丸治疗痛经的现代药理学机制尚未阐明。故本研究应用苯甲酸雌二醇和催产素联合的方法来制备痛经大鼠子宫平滑肌体外模型[6]，进一步从器官水平探讨调经赞育丸治疗痛经的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD 大鼠，SPF级，雌性，100只，20周龄左右，体重300 g左右，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2013-24，实验动物质量合格证号：0015873。实验动物鼠配合饲料由成都达硕实验动物有限公司提供，执行标准为GB14924.3-2010，将饲料放置于大鼠笼盖前面的饲养槽内，自由摄食。饮用水为生活用自来水，符合《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006），饮用水瓶放置于大鼠笼盖前面的专用位置，自由饮水。

动物饲养于成都中医药大学（以下简称“我校”）温江校区科技楼，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2014-124，处死前适应性饲养3～7 d。实验观察于我校民族药资源评价实验室（国家中医药管理局三级科研实验室，TCM-2009-320）进行。

动物实验研究的全程遵循了中国人民共和国国家标准 《实验动物福利伦理审查指南》（GB T 35892-2018）中的有关实验动物保护和使用的指南，并经我校实验动物伦理委员会批准。

1.2 试验药物

调经赞育丸由我校自制（批号：20171013），成人的日用剂量为3.10 g素丸，将其用洛氏液作为溶剂配制成（素丸）浓度为0.1856 g/mL的混悬液。将50、100、200 μL药液加入50 mL浴槽后，相应的药物终浓度分别为 0.1854、0.3705、0.7394 mg/mL。黄体酮注射液（阳性对照药）由浙江仙琚制药股份有限公司生产，规格为20 mg/mL，批号为170424。将50 μL药液加入 50 mL的浴槽后，相应的药物终浓度为0.02 mg/mL。苯甲酸雌二醇注射液（致敏试剂）由天津金耀氨基酸有限公司生产，规格为1 mg/mL，批号为1709171；缩宫素注射液（催产素注射液，造模工具药）由安徽丰原药业股份有限公司马鞍山药厂生产，规格为10 U/mL，批号为170823-1；将50 μL药液加入50 mL的浴槽后，相应的药物终浓度为0.01 U/mL。

1.3 仪器

生物信号采集处理系统（BL-420F型）、恒温平滑肌实验系统（HW200S型）和生物张力传感器（FT-100型），均由成都泰盟科技有限公司生产。

1.4 试剂

洛氏液（配方为氯化钠9.2 g/L、氯化钾0.42 g/L、碳酸氢钠0.5 g/L、氯化钙0.06 g/L先单独溶解后再加入，葡萄糖0.5 g/L临用时才加入[7]）；氯化钠由焦碱集团化学试剂厂生产（批号：20160809）；氯化钾由成都化学试剂厂生产（批号：170413）；碳酸氢钠由上海虹光化工厂生产（批号：160514）；氯化钙由天津市塘沽邓中化工厂生产（批号：20161108）；葡萄糖由四川菲德力制药有限公司生产（批号：171024）。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组 将大鼠按照体重分层，再随机分为六组，即空白对照组、模型对照组、黄体酮对照组[8]、调经赞育丸低浓度组、调经赞育丸中浓度组和调经赞育丸高浓度组。其中，空白对照组、模型对照组和黄体酮对照组每组5～10只动物，而调经赞育丸低、中、高浓度组每组10～20只动物。

1.5.2 雌激素增敏 实验前24 h按0.8 mL/只给大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇[9]，人工促使其处于动情期或动情前期，以提高子宫平滑肌对药物的敏感性。

1.5.3 仪器准备 调节仪器的温度调节旋钮使恒温在（37.0±0.5）℃，并将洛氏液放置其中，以保持在相同温度。调整压力传感器和生物信号采集处理系统，使其正常工作，调零并定标。

1.5.4 制备离体子宫平滑肌 取大鼠，股静脉放血处死，立即剖开腹腔，取出子宫并轻轻剥离其周围的脂肪组织，并用洛氏液将肠内容物冲洗干净，置于已经温热的洛氏液中（注意通气），将子宫剪成1.5～2.5 cm的片段2～4段（当天使用，不要过夜）[10]。子宫片断两端穿线接扎，一端系于通气钩上，然后轻轻放入恒温浴槽中，另一端系于压力转感器上，再连接记录仪。通氧气调节速度为1～2 s出现1个气泡，但不能影响平滑肌的自主舒缩运动。

1.5.5 操作步骤 先观察正常子宫的运动，调整浴槽内子宫平滑肌张力（给予1～2 g前负荷，使子宫平滑肌有一定的紧张度），使舒缩稳定1～2 min后，先描记一段子宫平滑肌正常运动的曲线，然后再向浴槽中滴加各种药液，并记录相应的舒缩曲线。

1.5.6 观察调经赞育丸对正常大鼠离体子宫平滑肌的影响 ①记录正常值（观察1～2 min）；②加入调经赞育丸溶液50 μL（观察1 min）；③1 min后再加入调经赞育丸溶液50 μL（观察1 min）；④1 min后再加入调经赞育丸溶液 100 μL（观察 5 min）[11]。

1.5.7 观察催产素对正常大鼠离体子宫平滑肌的影响①记录正常值（观察1～2 min）；②10 min后加入催产素 50 μL（观察 5 min）。

1.5.8 观察黄体酮对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响 ①记录正常值（观察1～2 min）；②加入催产素50 μL（观察1 min）；③1 min后加入黄体酮溶液50 μL（观察 5 min）。

1.5.9 观察调经赞育丸对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响 ①记录正常值（观察1～2 min）；②10 min后加入催产素 50 μL（观察1 min）；③1 min后加入调经赞育丸溶液50 μL（观察 1 min）；④1 min后再加入调经赞育丸溶液50 μL（观察1 min）；⑤1 min后再加入调经赞育丸溶液 100 μL（观察 5 min）。

1.5.10 测试指标 记录给药前后子宫平滑肌的收缩变化，分别对以下指标进行统计学处理[12]：平均张力值；频率；活动度（活动度=平均张力值×频率）。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 调经赞育丸对正常大鼠离体子宫平滑肌的影响

调经赞育丸低、中、高浓度组与空白对照组平均张力、频率和活动度比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示调经赞育丸对正常大鼠离体子宫平滑肌收缩的平均张力、频率和活动度没有明显的影响。见表1。

表1 调经赞育丸对正常大鼠离体子宫平滑肌的影响（±s）

表1 调经赞育丸对正常大鼠离体子宫平滑肌的影响（±s）

注：“-”表示无数据

组别 样本数（条）终浓度（mg/mL）平均张力值（g）频率（次/min） 活动度空白对照组调经赞育丸低浓度组调经赞育丸中浓度组调经赞育丸高浓度组10 10 10 10-0.1854 0.3705 0.7394 4.45±2.74 4.69±2.88 4.81±2.97 4.50±3.08 1.52±0.74 1.45±1.12 1.46±1.65 1.65±0.48 6.89±4.12 6.91±5.14 7.12±4.15 6.94±6.01

2.2 催产素收缩大鼠离体子宫平滑肌的作用

模型对照组平均张力值和活动度均明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示模型制备成功。见表2。

表2 催产素对大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响（±s）

表2 催产素对大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；“-”表示无数据

组别 样本数（条）终浓度（U/mL）平均张力值（g）频率（次/min） 活动度空白对照组模型对照组10 10-0.01 4.75±2.84 8.63±4.74*1.53±0.46 1.48±0.34 7.14±4.69 11.37±6.91*

2.3 黄体酮对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响

黄体酮对照组的平均张力值和活动度均明显低于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01），但两组频率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 黄体酮对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响（±s）

表3 黄体酮对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响（±s）

注：与模型对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；“-”表示无数据

组别 样本数（条）终浓度（mg/mL）平均张力值（g）频率（次/min） 活动度模型对照组黄体酮对照组10 10-0.02 4.58±1.94 1.15±0.87**1.38±0.77 1.24±0.41 6.75±2.19 1.68±1.21*

2.4 调经赞育丸对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响

调经赞育丸中、高浓度组平均张力值明显低于模型对照组（P＜0.05），调经赞育丸高浓度组活动度明显低于模型对照组（P＜0.05），但调经赞育丸低、中、高浓度组的频率与模型对照组比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 见表 4。

表4 调经赞育丸对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响（±s）

表4 调经赞育丸对催产素致大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响（±s）

注：与模型对照组比较，*P＜0.05；“-”表示无数据

组别 样本数（条）终浓度（mg/mL）平均张力值（g）频率（次/min） 活动度模型对照组调经赞育丸低浓度组调经赞育丸中浓度组调经赞育丸高浓度组10 10 10 10-0.1854 0.3705 0.7394 4.61±2.52 2.34±1.52 2.16±1.26*2.05±1.34*1.42±0.29 1.43±0.57 1.35±0.81 1.41±0.99 6.62±2.35 3.42±2.02 3.12±1.58 2.94±1.35*

3 讨论

原发性痛经是妇科常见疾病，以经期或行经前后周期性小腹疼痛或痛引腰骶为主要症状，临床发病率较高。原发性痛经与子宫内膜前列腺素合成、分泌关系密切，从而引起子宫平滑肌不协调收缩、甚至痉挛性收缩，造成子宫供血不足，导致厌氧代谢物积贮，刺激痛觉神经元而引起痛经。治疗主要采用解痉镇痛剂、前列腺素合成酶抑制剂、钙离子通道阻滞剂等[13-14]。中医学认为，痛经的发生与冲任、胞宫的周期性生理变化密切相关，主要病机在于邪气内伏或精血素亏，更值经期前后冲任二脉气血的生理变化急骤，导致胞宫的气血运行不畅，“不通则痛”，或胞宫失于濡养，“不荣则痛”，故使痛经发作[15-16]；常见的分型有肾气亏损、气血虚弱、气滞血瘀、寒凝血瘀和湿热蕴结[17-18]。调经赞育丸具有补益女性肾阳虚损的功能，适用于肾气亏损型痛经；现代研究认为，人参[19]、韭菜子[20]能兴奋下丘脑-垂体-性腺轴，当归、益母草[21]具有较好的调经止痛功能，川芎的提取物对大鼠子宫平滑肌的收缩有抑制作用[22]，均有利于痛经的治疗。

本研究通过雌激素增强大鼠子宫活动度，提高子宫平滑肌对催产素的敏感性，而后者可使子宫平滑肌收缩引起疼痛，从而运用苯甲酸雌二醇和催产素联合的方法来制备类痛经大鼠子宫平滑肌体外模型，符合人类原发性痛经的发病机制[23]。结果表明，催产素可导致大鼠离体子宫平滑肌收缩，具体表现为平均张力和活动度增加，但是对收缩频率没有明显影响。张丽梅等[5]观察到调经赞育丸对小鼠痛经具有明显的治疗作用，可能与其降低子宫平滑肌对催产素和PGF2α等激素的敏感性有关。本研究进一步从体外角度证实了调经赞育丸对痛经的治疗作用可能与抑制子宫平滑肌收缩有关。调经赞育丸中浓度（0.3705 mg/mL）和高浓度（0.7394 mg/mL）能明显抑制催产素致大鼠子宫平滑肌收缩，主要表现为平均张力和活动度的抑制作用，对收缩频率亦没有明显的影响。但是，调经赞育丸对正常大鼠离体子宫平滑肌收缩的平均张力、频率和活动度都没有明显的影响。本研究为调经赞育丸补益肾气、调经赞育功能的阐释奠定了药理学基础。

但是本研究未对调经赞育丸抑制催产素致大鼠子宫平滑肌收缩的机制进行深入研究，如可探讨调经赞育丸对子宫平滑肌 M、β、H1、H2[24]、κ、μ[25]受体的影响，此外，还可利用成分分析、系统溶剂法、血清药物化学等现代分离分析手段揭示其药效物质基础。