猪胸膜肺炎放线杆菌ftsI基因的克隆及分析

郝知友，邹玖零，禹小芳，屈蓓蓓，李英明，黄复深

（1.湖南省永州市畜牧水产局，永州 425000；2.湖南农业大学，长沙 410000）

0 引言

猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由猪胸膜肺炎放线杆菌感染引起的一种高度传染性呼吸系统疾病。主要表现为急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎，该病发病快，常引起大批猪只死亡[1]。该病的防治主要采用抗生素和灭活苗进行，但由于猪胸膜肺炎放线杆菌血清型多，各地流行存在差异，灭活苗交叉保护效果离临床要求较远，因此多采用抗生素进行治疗。抗生素的使用可能产生耐药性，因此需寻找新的药物靶点，筛选新的药物[2-3]。研究细菌细胞分裂是筛选药物新靶点的途径之一[4-5]。

FtsI是在细菌分裂过程中一个重要的蛋白分子[6]，FtsI是原核细胞分裂时的主要细胞骨架蛋白，与微管蛋白同源，细胞分裂时可与其他的细胞分裂蛋白组装成Z环，Z环的收缩促进细胞分裂。研究表明[7-10]：关于ftsI的报道主要见于植物叶绿体和人患疾病的研究，但是专门针对APP的FtsI基因及相应的编码蛋白却未见研究报道。目前研究最多的是FtsI，它广泛存在于原核生物、真核生物，而且不同物种中ftsI基因在序列和结构上呈现高度的保守性[4，11-14]。细菌细胞分裂与FtsI蛋白水平密切相关，纯化的ftsI蛋白是一种具有GTP酶活性的GTP结合蛋白[15]，而且GTP酶活性和ftsI蛋白的浓度密切相关。研究表明至少含有21个与App细胞分裂体相关蛋白质的基因参与了App的细胞分裂过程，其中ftsL参与分裂体成熟和稳定的肽聚糖（PG）结合蛋白基因[14]。本研究的目的是通过对App ftsI基因的分析，了解其在猪胸膜肺炎放线杆菌细胞分裂的意义，为下一步研究药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基

猪胸膜肺炎放线杆菌血清型Ⅰ于本实验室保存，胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）购自青岛日水生物技术有限公司，无支原体超级新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，NAD氧化型辅酶Ⅰ购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

PCR反应用试剂（2×Taq PCR Master Mix）、DNA标准分子量（D2 000 Maker）购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 FtsI基因的扩增与鉴定

常规方法提取细菌基因组DNA。根据GenBank中已收录的App基因组序列收录的FtsI基因序列，采用软件进行引物设计FtsI外引物一对。PF：5’-AAATCAGCACGAGGGAGATAAAA-3’，PR：5’-GTTTGCCCC TTATTCCTATCTTA-3'。FtsI基因的PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定后送上海生物工程公司测序。

1.4 ftsI序列

测序结果采用开放式阅读框ORF在线分析软件分析，跨膜区采用应用TMHMM软件和SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）软件分析，将其相应的氨基酸序列进行结构和功能分析。应用在线blast软件找出猪胸膜肺炎放线杆菌不同血清型的ftsI蛋白的相关序列，用临接法（NJ）绘制出基因进化树进行分析，同时采用Megalign软件对不同血清型的所有蛋白质序列进行相似性分析。

2 结果

2.1 APP的ftsI目的基因PCR扩增结果

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型1的基因组为模板，对目的基因ftsI进行PCR扩增。将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见一条2 000 bps左右的特异扩增产物带，与目的基因基本一致，ftsI基因PCR扩增电泳图见图1。核苷酸序列在GenBank登录，登录序列号：KT253252。经ORF分析发现，该基因全长1 752 bp，含1个完整开放的阅读框（ORF），由起始密码子ATG至终止密子TAA，编码584个氨基酸，编码蛋白的理论分子量为42.6 kD，等电点为4.72。

2.2 ftsI基因序列

ftsI基因序列与GenBank中已报道的APP的血清1、3、5、7、8型相似度为96%～100%。系统进化树可见，App的ftsI基因属于进化的一个分支，与副嗜血杆菌有相近的亲缘关系，而与大肠杆菌等的亲缘关系较远，ftsI的系统发育见图 2。

图1 ftsI基因PCR扩增电泳图

图2 ftsI的系统发育

2.3 ftsI蛋白质结构与功能

应用SOPMA软件和TMHMM软件分析发现，FtsI蛋白跨膜蛋白具1个跨膜区，跨膜区分析见图3。二级结构预测具有α-螺旋区、β-折叠区、β-转角区和无规卷曲4个结构类型，其中α-螺旋区占二级结构的66.90%，β-折叠占二级结构的60.00%，转角占15.40%。分析三级结构，发现其具有2个模块（Motif），App FtsI的三级结构见图4。

图3 跨膜区分析

3 讨论与结论

研究表明猪胸膜肺炎放线杆菌呈短杆状或球杆状，菌体长短不一，菌体表层面有绒毛，其一端有一明显的凹陷；细胞的分裂可发生在细胞中部或细胞的一极。至少含有21个与App细胞分裂体相关蛋白质的基因参与了App的细胞分裂过程，其中ftsL参与分裂体成熟和稳定的肽聚糖（PG）结合蛋白基因的过程[14]。

图4 App FtsI的三级结构

研究从App基因组中扩增了App的FtsI 基因。研究表明该基因全长1 746 bp，含一个开放阅读框（ORF），由起始密码子ATG至终止密子TAA，编码582个氨基酸。编码蛋白的理论分子量为42.6 kD，等电点为4.72。与APP的血清1、3、4、5型相似度为96%～100%。系统进化分析表明，App的ftsI基因属于进化的一个分支，与副嗜血杆菌有相近的亲缘关系，而与大肠杆菌等的亲缘关系较远。蛋白质序列分析发现，ftsI蛋白在APP各血清型的同源性甚高，该蛋白可能成为App的广普药靶，且在其他病原菌也有一定的作用。

细菌细胞分裂涉及一类对热敏感的基因，当外界环境的温度升高时，这些基因的突变体表现出分裂活动的停滞，形成不分裂的长丝状菌体，但在正常的生长温度条件下，则进行正常的细胞分裂活动，这些对热敏感的细胞分裂突变体统称为fts突变体[8]。研究表明fts突变体涉及多个基因的参与，包括ftsL、ftsI、ftsW、ftsQ、ftsA、ftsZ、ftsJ、ftsH、ftsK、ftsB、ftsX、ftsY等，这些基因编码的蛋白质参与细菌细胞分裂中的多个过程[4]。

研究以App血清1型基因组DNA为模板，PCR扩增出ftsL的目的基因片断。FtsI广泛存在于细菌中，是细胞分裂的一种重要功能蛋白。细菌细胞分裂时，单体FtsI蛋白聚集在一起组装合成肌纤维，于分裂位点处形成Z-ring（Z环），与细菌细胞质膜内表面镶嵌。Z环所在平面为分裂母细胞分裂部位[16]。FtsI的N端具有ATPase结构域，水解GTP，为质膜收缩供给动力，并顺利分裂细胞[10]，FtsI与其他细胞分裂相关调节蛋白的共同作用，参与DNA的分离和细胞生长等重要生理过程[10，13]。同时，FtsI参与细菌细胞分裂时染色体的凝集[17]以及细胞壁的形成[16]。绿脓假单胞菌的研究表明，该基因的表达与细菌的耐药性相关[18]，该研究为进一步研究App的 FtsI的功能及其在药物筛选的意义奠定了基础。