虾蟹动物性别决定和分化机制研究现状与展望

张 银，林 帆，石 西，Khor Waiho，马洪雨

（1.汕头大学广东省海洋生物技术重点实验室，广东 汕头 515063 2.汕头大学汕头大学-马来西亚登嘉楼大学虾蟹贝类联合实验室，广东 汕头 515063）

0 引言

脊椎动物的性别形成包括性别决定和性别分化两个过程，性别决定在精卵结合的瞬间就已经完成，决定了性腺将来向精巢或卵巢发育的方向；而性别分化则是由遗传性别向性腺性别演变的个体发育过程[1].虾蟹动物属无脊椎动物，其中部分大型虾蟹动物不仅营养丰富，味道鲜美，而且具有很高的经济价值[2].据记载，自2012年起，全球虾蟹动物的水产养殖产值就已经突破300亿美元，而深入了解养殖它们性别决定、分化及繁殖机制是产业可持续发展的核心问题[3].同时，性别决定和分化是发育生物学、遗传学、胚胎学等领域的热点科学问题.再者，部分经济虾蟹动物在生长速度、个体大小、市场价格等方面表现出明显的雌雄差异.因此，对虾蟹动物的性别决定和分化机制进行深入研究，不仅有助于丰富甲壳动物性别决定的理论基础，还可以推动人工性别调控技术的开发[4]，指导单性养殖和育种，从而促进水产养殖业发展，提高经济和社会效益.

1 虾蟹动物性别决定和分化机制

在物种系统进化过程中，虾蟹动物处于承前启后的重要位置，与高等脊椎动物相比，其性别决定机制具有原始性、多样性和可塑性的特点.虾蟹动物的性别决定和分化主要有遗传决定型和环境决定型两种模式，遗传决定型是指生物体的性别由遗传因素—性染色体决定，而环境决定型是指生物性腺性别尚未分化前受到环境因素的影响而导致性别分化方向发生改变[4].此外，甲壳动物特有的内分泌腺——促雄性腺在虾蟹动物性别决定中也扮演着重要的角色.

1.1 遗传决定型

虾蟹动物进化地位较低等，性别决定机制大多原始且复杂，主要由性染色体决定.19 世纪末，Carnoy[5]首次报道了褐虾（Cargon cataphrastus）和普通滨蟹（Carncinns manus）的染色体核型.随后，世界各国的科学家们对虾蟹动物染色体开展了广泛的研究.通过染色体核型分析来确定动物的遗传性别是一种行之有效的方法.Torrecilla等[6]通过染色体核型分析，在十足目动物中发现了异形性染色体.然而，由于虾蟹动物的染色体数目较多（从40多对到120多对），且形态较小，同时处于有丝分裂中期的染色体大多呈点状，着丝点难以分辨，所以给核型分析带来了较大的困难.大多数虾蟹动物中并未发现异形性染色体，这可能与其在进化中的地位以及性染色体分化不明显有关，但并不意味着不存在性染色体[4].

除染色体核型分析外，还可以采用传统育种技术，通过分析后代雌雄比例的方法间接预测性别决定类型.例如，Malecha等[7]通过性逆转和杂交等方法发现罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的性别决定类型可能为ZW/ZZ型，杂交方法还被用来推测斑节对虾（Penaeus monodon×Penaeus esculentus）的性别决定类型为ZW/ZZ型[8].另外，三倍体诱导的方法被用来证明中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）的性别决定机制可能为ZW/ZZ型[9].

随着现代分子生物学和高通量测序技术的快速发展，性别连锁分子标记和遗传图谱也被用来确定虾蟹动物的性别决定机制.如采用遗传作图方法将凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）和日本对虾（Penaeus japonicus）的性别特异位点定位在雌性遗传连锁群中，表明这两种对虾的性别决定类型很可能为ZW/ZZ类型[10-11]；采用同样的方法还发现了斑节对虾（Penaeus monodon）的W和Z染色体对应的连锁群，证实了6个雌性连锁分子标记具有由母本遗传给女儿的遗传规律，验证了斑节对虾的性别决定机制为ZW/ZZ类型[12].我国学者将中华绒螯蟹的性别决定位点定位在遗传图谱中，并鉴定到与雌性紧密连锁的分子标记，发现了Z和W染色体对应的连锁群，说明该物种的性别决定机制为ZW/ZZ类型[9].通过高密度遗传图谱定位性别连锁位点的方法具有较强的可行性，能够弥补传统方法的不足，为揭示甲壳动物性别决定和分化机理开辟新的途径.作者所在实验室筛选到拟穴青蟹（Scylla paramamosain）雌性特异的SNP分子标记，并将其定位于高密度遗传连锁图谱中，推测拟穴青蟹的性别决定类型ZW/ZZ（未发表）；同时，筛选到锈斑蟳（Charybdis feriatus）雄性特异的SNP分子标记，推断锈斑蟳（Charybdis feriatus）的性别决定类型为XX/XY（未发表）；但是，在远海梭子蟹（Portunus pelagicus）只筛选到性别相关SNP分子标记，并未获得性别特异分子标记（未发表）.

目前，在虾蟹动物中，已有多个物种的遗传性别决定类型被报道出来（表1）.虾蟹动物染色体性别决定类型主要有4类：（1）XX/XY型，即雌性同配、雄性异配型，如据Niiyama[13]的观察，在6个等足目物种中有一个具有异型的性染色体，在26个十足目物种中有8个具有异型的性染色体，其中在斜文蟹属（Plagusia）、绒螯蟹属（Eriocheir）、近方蟹属（Henngrapsus）和长额虾属（Pandalus）等一些种的雄性个体中发现有异型性染色体（X-Y）[14]；（2）ZW/ZZ型，即雌性异配、雄性同配型，如罗氏沼虾属于ZW-ZZ染色体性别决定机制，雌性为异型染色体（ZW），雄性为同型染色体（ZZ），并且这种决定机制具有不完全性，可能还受环境、上位或其他遗传因素影响[15].在蛤虾（Eulimnadia texana）中，雄性个体是纯合的ZZ型，雌雄同体的个体是ZW或WW型，而WW型个体只能产生雌雄同体的后代[16].（3）XX/XO型，即雄性少一条染色体，有研究发现细点圆趾蟹（Ovalipes punctatus）[17]和春蟹（Potamon fluviatile）[18]的性染色体类型是 XX/XO 型.（4）复性染色体，研究表明铠甲虾科中的雄性颈刺铠虾（Cervimunida princeps）具有X1X2Y染色体决定类型[19]，而锯齿长臂虾（Palaemon serratus）属于X1X1X2X2/X1X2Y染色体决定类型[6].

表1 虾蟹动物染色体性别决定类型汇总

1.2 环境决定型

虾蟹动物的性染色体或性别决定机制处于进化的早期阶段，遗传因素对性别的决定强度明显低于高等脊椎动物，其性别决定和分化易受外界环境的影响.作为生活在开放性环境中的类群，虾蟹动物的性别决定及其分化有可能受温度、光照、盐度及性激素等影响[4，25].

研究表明，采用高温处理中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）受精卵后，其群体性别比例发生了显著变化（P＜0.01）[26].同样，温度能够影响杜氏钩虾（Gammarus duebeni）的性别比例，若亲虾的生活水温为5～8℃，则后代中包含雌、雄个体；若低于5℃时，则后代均为雄性；若高于8℃时，则后代均为雌性.进一步的研究表明，若亲虾的生活水温为13℃，在产卵前几天将其置于4.5℃水体中生活1天时间，就足以使其后代均为雄性；若先使父本在4.5℃水体中生活两星期，之后再放置到13℃水体中，并在1～2天内与母本交配，则产生的后代几乎全部为雄性[27].还有研究表明，采用温度休克的办法处理中国对虾受精卵，则后代的雌性比例高达86%（75～93.2%）[28].除此之外，季节也会对虾蟹动物的性别比例产生一定影响，如在寒冷季节，褐虾的雌性个体数量明显多于雄性个体（约3倍）；在夏季，两性之比约为1∶1；而到了秋季，雌性数量又明显少于雄性[4].在4～5月份，拟须虾（Aristaeomorpha foliacea）的雌性个体数量多于雄性，而在8～10月份，则以雄虾居多[29]；在春季，鹰爪虾（Trachypenaeus curvirostris）的雌性个体数量多于雄性，而在秋季，则刚好相反[29]；克氏原鳌虾（Procambarus clarkii）雄性个体的倒刺也随季节而变化，在春夏交配季节倒刺长出，而秋冬季节倒刺消失[30].

研究表明，光照也能够影响虾蟹动物的性别决定和分化.光照周期不但可以影响云斑厚纹蟹（Pachygrapsus marmoratus）雌性个体的生殖功能[31]，而且能够影响杜氏钩虾的性别比例[32].用紫外线照射可诱发虾蟹动物雄性个体产生[29].Wu等[25]认为光照周期影响甲壳动物的性别分化的原因可能是通过影响神经分泌细胞的分泌活动进而控制促雄性腺的分化而实现的.

盐度被认为可能通过影响甲壳动物血淋巴中的性激素浓度进而影响性腺分化[25].研究表明，水体盐度升高可引起1秋龄雌性中华绒螯蟹血淋巴中雌二醇水平和Ca2+含量上升，导致雌性中华绒螯蟹性早熟，而血淋巴中雌二醇含量与盐度之间具有剂量依存关系[33].

据报道，脊椎动物的性激素如 17-β雌二醇（17-β estradiol）、甲基睾丸酮（methyltestosterone）、己烯雌醇（stibestrol）、己烷雌酚（hexoestrol）等对虾蟹动物性别决定几乎不起作用，只能促进性腺的发育、胚子形成及幼体生长[34-35].利用17α-甲基睾丸酮投喂罗氏沼虾，并没有显著改变其性别比例[36].王桂忠等[37]用己烯雌酚处理锯缘青蟹（Scylla serrata）幼体，未能改变其性别，但加速了个体生长发育.同样，使用性激素处理长毛对虾（Penaeus penicillatus）[38]、中国对虾[21，39]，也未能改变其性别.然而，Kulkarni[40]将睾酮和孕酮以不同时间、不同剂量分别注射哈氏仿对虾（Parapenaeopsis hardwickii），结果分别促进了雄虾精子生成和雌虾卵巢成熟.

1.3 内分泌腺

促雄性腺（Androgenic gland）是甲壳动物特有的内分泌腺，通常位于输精管或精巢附近，能够分泌促雄性激素（Insulin-like androgenic gland hormone，AGH），而AGH是雄性分化的主要调控因子[35].Katakura[41]将移入促雄性腺而雄性化的西瓜虫与正常雌性个体交配，所得后代再与雄性化雌体交配，得到全雌后代.类似的方法最早在罗氏沼虾中得到充分的利用，不仅成功获得性逆转罗氏沼虾，而且利用性逆转罗氏沼虾与正常雄性或雌性交配分别获得了全雄化或高比例雌性（3∶1）的后代，从而成功完成了单性繁殖[7，42-43].随后，在端足目、等足目和十足目等多种甲壳动物中的研究表明，将雄性的促雄性腺移除或将其植入雌性个体中，能引起雄性个体雌性化或雌性个体雄性化[23，34-35，44-47].刘红等[48]将锯缘青蟹和中华绒螯蟹的促雄性腺提取物分别注射到刚完成性别分化的中华绒螯蟹雌性幼蟹体内，观察到了雄性化现象，并且发现很低浓度及剂量的提取物即可引起性反转.

此外，有研究发现，眼柄中X器官-窦腺复合体（X-organ-Sinus-glad complex，XOSG）所分泌的性腺抑制激素（Gonad inhibiting hormone，GIH）和蜕壳抑制激素（Moltinginhibitinghormone，MIH）能够通过XO-SG-AG-Gonad轴调控精巢的发育，因此，摘除眼柄能够引起促雄性腺细胞肥大增生，促进AGH分泌，从而促进精巢发育[49].

2 性别决定和分化相关基因

2.1 性别决定相关基因

目前，在虾蟹动物中已经鉴定出一系列存在于模式动物中的性别决定开关基因的同源基因，包括果蝇中的性别决定基因Sxl、下游调控基因Tra和Tra-2以及线虫中的基因Fem-1的同源基因[49].然而，由于性别决定系统的复杂性，这些同源基因在虾蟹动物中是否起到性别开关作用仍不清楚.

尽管性别决定的开关基因在不同物种间的保守性不强，但其下游的性别决定主效基因却相对保守[50].Dmrt（Doublesex and Mab-3 related transcription factor）是一类具有DM结构域的转录调控因子，无论在脊椎动物还是无脊椎动物中，Dmrt在精巢分化和发育过程中均起到非常重要的作用.学者在中华绒螯蟹中鉴定出Dmrt-like基因（Dmrt-like gene），该基因与脊椎动物同源基因十分相似，在精巢中特异表达，采用RNA干扰方法能够抑制中华绒螯蟹精巢的发育[51-52].在罗氏沼虾中，学者克隆到两种Dmrt基因（Dmrt11E和Dmrt99B），这两种基因表现出相似的性别差异表达模式[53].对Dmrt11E基因进行干扰，能显著降低促雄性激素基因（AGH）的表达，这表明Dmrt11E可能是AGH基因的上游调控因子[53].相似地，在中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）中也克隆到Doublesex（Dsx）的同源基因Dsx，其表达模式也表现出性别差异性，敲降该基因同样能降低AGH的表达[54].此外，在东方多刺龙虾（Sagmariasus verreauxi）中鉴定出了Y连锁的Dmrt基因（iDMY），是常染色体iDmrt1的删减版本，该基因可能通过显性负效应（Dominant Negative Effector）调控常染色体iDmrt1基因的功能而发挥性别决定的作用[55].

促雄性腺能够分泌促雄性腺激素，在甲壳动物性别调控中发挥着重要的作用.目前，已在多种虾蟹动物中鉴定到其编码基因（insulin-like AG hormone，AGH），包括：拟穴青蟹[56]、蓝蟹（Callinectes sapidu）[57]、远海梭子蟹[58]、中国对虾[59]、罗氏沼虾[60]和美洲龙纹鳌虾（Procambarus fallax）[61]等.在罗氏沼虾中，学者通过干扰AGH基因的表达引起雄性表型衰退并成功实现性逆转[62]，这表明AGH在精巢发育中起重要作用.此外，AGH可以平衡双性澳洲红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）的雌雄比例，敲降AGH基因可以导致精巢发育受阻，精子产量减少并促进卵黄生成[63].近年来的研究发现，AGH基因在蓝蟹[64]和拟穴青蟹[65]卵巢中表达，且其表达量在青蟹卵巢成熟期急剧升高[66]，说明AGH基因可能在部分虾蟹动物卵巢发育成熟过程中发挥重要作用，但AGH在卵巢发育过程中的具体作用机制还有待于进一步研究.

2.2 性别分化相关基因

在虾蟹动物中，性别分化发生在性别决定过程之后.性别分化的标志之一便是性腺开始分化，而性腺分化是一个连续渐进的过程，不同物种性腺分化的时期也不尽相同.例如，中华锯齿米虾（Neocaridina denticulata sinensis）的性腺组织切片研究表明，其性腺分化是开始于胚后期[67]；凡纳滨对虾的外部形态分化早于生殖腺的分化，发育为仔虾后的第43天可观察到生殖管，而生殖腺在第55天才开始出现分化[68]；日本绒螯蟹在大眼幼体期就可通过生殖管的不同定向区分出雌雄[69]；在日本对虾中，雄性生殖管在仔虾阶段第20天可以辨别出，而性腺分化最早在仔虾阶段第60天可观察到[70]；在中国对虾中，性腺分化现象在仔虾阶段第76天可被观察到[71].此外，尹左芬等[72]报道了对虾外生殖器官的发育与分化情况；林琼武等[73]从解剖学和组织学的角度对锯缘青蟹幼体性别分化时期进行了研究.

目前，关于虾蟹动物性腺发育的研究已深入到分子生物学水平，越来越多参与性腺性别分化的基因被成功克隆，如Vasa基因[74-75]、foxl2基因[76]、卵黄蛋白原基因（Vitellogenin，Vg）[66-77]、蜕皮激素受体基因（Ecdysone Receptor，EcR）[78]及SoxB2 基因[79]等.Fu等[80]通过对处于繁殖期的中华绒螯蟹促雄性腺的转录组进行测序，挖掘到与性别分化相关的基因，如：AGH、Sxl、Tra-2、Sry、Ftz-f1、Foxl2、Fem-1等，这些基因与雄性精巢发育和精子形成有关.利用RNA干扰技术，学者们在拟穴青蟹中发现EcR可能通过调节Vg的表达促进卵巢发育，胰岛素样多肽（Insulin-like polypeptides）可以通过PI3K/AKT/TOR信号通路促进卵黄蛋白的合成[66].此外，研究还发现SoxB2基因在中华绒螯蟹精子细胞核的成熟过程中发挥重要作用[79].

随着二代、三代高通量测序技术的快速发展，对功能基因的研究由单一、小规模的研究逐渐转向大规模、批量化的组学研究.利用二代测序技术，学者们获得了大量的虾、蟹性腺转录组信息，包括与性腺分化相关的基因，如Foxl2、Wnt4、Ftz-f1、Fst、Fem-1、Sox9、Vg等[80-84].此外，通过对精巢和卵巢的转录组进行研究，作者所在实验室鉴定出大量与拟穴青蟹性腺分化和发育相关的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和功能基因，并初步探讨了lncRNAs对靶基因的调控机理[85].然而，关于基因在虾蟹动物性腺分化与发育过程中的功能研究依然十分缺乏.

3 展望

随着虾蟹动物养殖业的快速发展，对虾蟹动物性别决定和分化生物学问题的研究愈发显得重要.分子生物学和基因组学技术的快速发展为性别决定和分化机制研究提供了新的研究思路和方法.近年来，通过发掘性别连锁分子标记、构建高密度遗传图谱以及采用多组学结合的方法已逐渐被用于探索虾蟹动物性别决定及分化机制.

相对于鱼类及其他模式物种，虾蟹动物性别决定和分化的研究还处于相对落后的阶段，诸多性别相关的生物学机理尚不清楚，如：性别决定的开关基因、性腺分化关键期和性腺发育的调控机制等.此外，由于物种本身的特殊性（受精、胚胎生物学特性及孵化方式等），一些可以在模式生物上广泛应用的分子生物学技术如显微注射、基因编辑等还难以应用于虾蟹动物.

以性别控制研究为例，通常虾蟹动物雌雄外部形态的分化要早于性腺的分化，如果不明确性腺分化关键期，研究者就很难在合适的时机（性腺分化前）开展促雄性腺移植实验，最终限制了性反转实践.同样，在研究性别决定基因的生物学功能时，如果不能在性腺分化前实施基因干扰，就无法证实该基因的功能.因此，一方面我们要利用现有的技术方法揭示虾蟹动物性别决定和分化的科学规律；另一方面，要开发新的适合虾蟹动物的基因功能研究方法，更精准的阐明性别相关科学规律.