疏毛罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力的影响

张秋妍，赵 静，孙晶晶，张芙蓉，赵海君，屈长青*

（阜阳师范学院 a.生物与食品工程学院；b.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳 236037）

疏毛罗勒（Ocimum basilicum Linn var.ppilosum(wild.)Benth），一年生草本植物，为唇形科植物，是一种药食两用植物，全草入药，治胃肠胀气、消化不良、肠炎腹泻、外感风寒、跌打损伤瘀肿、风湿性关节炎等疾病，可广泛应用于食用、食品工业、日用化工和医药保健等方面，目前在河南、安徽淮河以北多有种植。罗勒多糖是其中重要的生物活性物质[1]，而目前对罗勒多糖的研究主要集中在肿瘤浸润、转移、抗血栓抗氧化等相关方面[2]，本实验室研究发现，罗勒多糖与维生素C一样，对酪氨酸酶有抑制作用，并且抑制作用明显[3]，但罗勒多糖用在对巨噬细胞影响方面鲜有报道。

巨噬细胞（Macrophages）属于免疫细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫（先天性免疫）和特异性防卫（细胞免疫），主要功能是吞噬细胞残片及病原体，并激活淋巴球或其它免疫细胞，令其对病原体作出反应，促进机体康复[4-5]。本文探究了罗勒多糖对体外培养小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响，为罗勒新药用价值的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

昆明小白鼠（购于安徽医科大学动物饲养中心）；疏毛罗勒（购于阜阳农贸市场，为当年4月份采摘，洗净晾干）；低糖 DMEM（货号11885500BT，Gibco）；小牛血清（货号 11011-8611，杭州四季青）；中性红（货号N835635，上海麦克林）；CO2培养箱（Forma3111，美国 Thermo Scientific Forma公司）；全自动酶标仪（ELX800，美国Bio-Tek公司）；倒置显微镜（ckx31，日本OLYMPUS公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 罗勒多糖的提取

采用水煮醇沉法[6]：取阴干的罗勒，粉碎机粉碎待用。称取40 g罗勒粉末加200 mL蒸馏水浸泡24 h，90℃加热1 h，纱布过滤，3 500 r/min离心15 min，取上清液，加入4倍体积无水乙醇，4℃低温静置24 h醇沉，3 500 r/min离心15 min，先后用无水乙醇、丙酮、无水乙醚脱脂纯化，用蒸馏水溶解沉淀（不离心），用Sevag法去除蛋白[Sevag液为氯仿∶戊醇=4∶1（V∶V），浓缩液∶Sevag液=4∶1，充分振摇30 min，3 500 r/min离心5 min]，重复多次，收集上清液，加入无水乙醇使乙醇浓度达到80%，4℃低温静置24 h醇沉，3 500 r/min离心15 min，沉淀物在50℃水浴锅蒸发，然后自然晾干至恒重，干品即为罗勒粗多糖。称100 mg溶于10 mL的蒸馏水，充分溶解，即为10 mg·mL-1的罗勒多糖溶液。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞的提取与纯化

将小鼠断颈处死，75%的乙醇浸泡5 min，置入超净工作台内固定。无菌条件下把小鼠腹部皮肤剪开一条线，然后双手持镊子撕开皮肤拉向两侧，暴露腹膜，用注射器吸取无菌DMEM 4～6 mL注入小鼠腹腔，然后轻柔小鼠腹腔5 min再反复吸回DMEM，1 000 r/min离心10 min，弃上清加入红细胞裂解液 5 mL，离心，重复两次。用DMEM低糖培养液调整细胞浓度，以2×105～4×105个/cm2的密度接种细胞于96孔板，每孔120µL。放置于37℃，5%CO2培养箱中培养，4 h后吸弃培养液并用DMEM洗去未贴壁细胞，获得的贴壁细胞即为纯化的巨噬细胞[5]。然后加入罗勒多糖浓度梯度培养液，放入CO2培养箱中继续培养。

1.2.3 中性红法测定巨噬细胞吞噬活性[7]

罗勒多糖浓度梯度培养液培养48 h后每孔加入100µL的0.1%中性红悬浊液，继续孵育4 h后弃去孔内液体，用PBS液缓慢冲洗3次，然后每孔加120µL细胞裂解液[无水乙醇∶冰乙酸=1∶1（V∶V）]，于微孔振荡器上震荡 15 min，用酶标仪在490 nm处测定吸光度（OD），以OD值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。计算吞噬率，巨噬细胞吞噬率（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.2.4 统计学处理

采用统计学的方法，对数据进行分析，文中所用的数据都是以（平均数±标准差）表示，采用SPSS 21.0对实验组和对照组进行显著性差异分析，当P＜0.05时，说明实验组与对照组有显著性差异，其中，当P＜0.01时，说明实验组与对照组之间有极显著差异。

2 结果

2.1 罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力影响

由图1可知，随罗勒多糖浓度升高巨噬细胞OD值增大，表明罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性有促进作用，浓度升到100/μg·mL-1时，与对照组相比达到极显著水平。

图1 罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力的影响*表示与对照组相比，P＜0.05；**表示与对照组相比P＜0.01

2.2 不同浓度的罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响

由吞噬曲线可以看出，罗勒多糖在0～100 μg·mL-1范围内吞噬率明显升高，100 μg·mL-1之后吞噬率增加的缓慢。

图2 不同浓度的罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响

3 讨论

罗勒多糖是疏毛罗勒的重要生物活性物质[1]，而目前对罗勒多糖的研究主要集中在抑制肿瘤转移、降血糖血脂等相关方面，赵庆华等通过Metrigel穿膜法体外观察罗勒多糖对肿瘤细胞迁移的影响，发现罗勒多糖后的PG细胞，穿过人工基底膜的细胞数显著减少，对黑色素瘤B16-F10人工肺自发性转移行为具有明显的抑制作用并对细胞通讯功能缺陷的PG细胞具有一定程度的恢复作用[8]，陈锋等研究了罗勒水提取物和多糖对高血脂和高血糖大鼠模型的降低作用，实验发现其具有降血糖和降血脂作用[9]，本实验室前期研究发现，罗勒多糖与维生素C一样，对酪氨酸酶有抑制作用，并且抑制作用明显[2]，但罗勒多糖用在对巨噬细胞影响方面鲜有报道，米娜瓦尔·哈帕尔等发现罗勒提取物体外对经脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞生长的最大抑制质量浓度为100 μg·mL-1，对细胞内 5-脂氧酶活性具有抑制作用[10]。还有研究表明，罗勒多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种供试菌的生长有抑制作用[11]，罗勒多糖还能提高荷瘤小鼠NK细胞的杀伤活性[1]。

尚庆辉等报道植物多糖可以通过增大巨噬细胞体积、提高吞噬活力、调节巨噬细胞细胞因子的分泌量来提高机体免疫力[12]。另外有文献报道植物多糖可通过NF-κB信号传导通路诱导巨噬细胞发生免疫应答，并且可以通过TLR4、TLR2受体介导巨噬细胞激活细胞内信号通路，促进相关细胞因子的释放，发挥其免疫调节功能[13]。本实验通过小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红颗粒，发现罗勒多糖具有较强的增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，提高机体免疫功能。罗勒多糖能够提高机体提高巨噬细胞的吞噬能力的机制可能与引起巨噬细胞NF-κB活性有关，也可能通过TLR4、TLR2受体介导巨噬细胞激活细胞内信号通路，促进相关细胞因子的释放，发挥其免疫调节功能，其具体作用机制还需通过对TNF-α、ROS、NO等细胞因子的合成量的测定来进一步验证。另外本实验采用的水煮醇沉法提取的罗勒多糖为粗多糖，粗多糖中的具体成分还需进一步进行分离、提纯、试验验证。但罗勒多糖能够提高机体免疫监视已被再次证明，并可能成为一种增强免疫的新型药物，本实验也为罗勒多糖药用价值的进一步开发和临床应用提供理论指导。

4 小结

近年来有关罗勒多糖在对巨噬细胞影响方面报道较少，本实验采用的水煮醇沉法提取罗勒多糖，用不同浓度的罗勒多糖处理小鼠腹腔巨噬细胞，测定罗勒多糖对巨噬细胞的吞噬活力。随着罗勒多糖浓度的升高，巨噬细胞的吞噬活力增强，当罗勒多糖浓度达到100μg·mL-1时，与对照组相比达到极显著水平（P<0.01），提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的罗勒多糖最佳浓度是100μg·mL-1。综上可得罗勒多糖可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力。