毛花苷C促进肝癌细胞Huh-7凋亡并增强caspase-7的活化

张艳群，徐 庆，曾永联，罗 琴，邹海凡，谭 宁

(桂林医学院1.药学院、2.广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室、3.科学实验中心，广西 桂林 541004)

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，全国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡总人数的51%[1]。目前，医治HCC仍以手术为主，兼物理疗法、化学药物疗法等在内的综合治疗。临床常用的肝癌化疗药物如蒽环类抗瘤药等，缺乏高度的组织选择性，在发挥疗效的同时，往往产生较严重的全身性毒副作用[2]。因此，如何使化疗药物既提高肿瘤化疗效果，又减轻化疗药物的毒副作用，已成为肿瘤药物治疗亟待解决的关键问题。

强心苷类(Cardiac glycosides，CGS)是一类从植物中提取的类固醇衍生物，能明显兴奋心肌细胞，目前作为心衰和心房颤动的常用治疗药物。自1960年，相继有研究发现，洋地黄毒苷、地高辛、哇巴因等强心苷类药物具有预防和治疗肿瘤的作用[3]。Stenkvist等[4]研究表明，乳腺癌患者在使用洋地黄治疗后，肿瘤转变为良性的比例升高，且在乳房切除术5年后，使用洋地黄治疗的患者乳腺癌复发率仅为对照组的10.42%。同时，Goldin等[5]在给予127位癌症患者使用洋地黄治疗后，发现21例癌症死亡中仅有1例属于洋地黄组。并且CGS能选择性地抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，而对正常细胞无明显影响[6]，因而强心苷类化合物被认为是一类新型的抗癌药物。为了进一步证实CGS抗肿瘤治疗的临床价值，美国FDA正在进行小规模的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，结果尚未公布。本实验采用不同浓度的毛花苷C(lanatoside C)溶液干预肝癌Huh-7细胞，研究毛花苷C对其增殖、凋亡及凋亡相关酶caspase-7活化的影响，初步探讨毛花苷C对肝癌的抑制作用，为其临床应用提供基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 肝癌Huh-7细胞株购自中科院上海生物科学研究所细胞资源中心。

1.1.2试剂 毛花苷C(上海旭东海普药业有限公司，CAS：#17575-22-3)，采用嘧啶试剂作溶剂溶解毛花苷C，使其终浓度为20 g·L-1，过滤除菌后，室温避光存放备用。DMEM高糖培养基(Gibco公司，货号11885-076)；胎牛血清FBS(Corille公司，C1015-05)；Cell Counting Kit-8试剂(上海同仁化学研究所，CK04)；caspase-7单克隆抗体(12827)购自CST公司；抗β-actin一抗(SC-47778)购自Santa Cruz公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(上海东仁化学科技，AD10)。

1.1.3仪器 Elix3+30L+3YNERGY超纯水系统(美国Millipore公司)；311气套式CO2培养箱(美国Thermo公司)；Infinite M200 pro Nano Quant光栅型连续波长酶标仪(瑞士TECAN公司)；Allegra X-22R冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；BD FACSAriaⅢ分选型流式细胞仪(美国BD公司)；LSM710激光共聚焦扫描显微镜(德国蔡司公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将Huh-7细胞接种于含支原体抗生素的改良DMEM培养基中，培养于37℃、5% CO2培养箱中，胰蛋白酶常规消化传代，选择处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2细胞增殖实验 胰酶室温常规消化细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，按1×103个/孔接种于96孔板中，培养于37℃、5% CO2培养箱中，细胞贴壁24 h后，加入毛花苷C使其终浓度为0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，以等体积嘧啶作为对照，同一浓度设置3个复孔，分别培养2 h及1、3、5、7 d后，弃去培养基，每孔加入CCK-8溶液100 μL，继续培养2 h后，使用酶标仪检测450 nm波长处吸光值。增殖抑制率/%=(对照组A450值-加药组A450值)/对照组A450值×100%。

1.2.3克隆形成实验 胰酶室温常规消化细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，按1.6×103个/孔接种于6孔板中，继续培养于恒温培养箱中。培养10 d后加毛花苷C，使其终浓度为0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，以等体积嘧啶代替毛花苷C作为对照组，同一浓度设置3个复孔，再继续培养6 d后弃去上层培养基，PBS轻柔洗板2次，细胞用4%多聚甲醛固定15 min，弃多聚甲醛，结晶紫溶液染色15 min，清水反复浸洗，室温晾干，采集图像保存后，每孔加入2 mL 10%的冰醋酸溶液溶解结晶紫，每孔再取100 μL置于96孔板中，使用酶标仪检测各孔560 nm波长处吸光度值，并按以下公式计算克隆抑制率[7]。克隆抑制率/%=(对照组A560值-加药组A560值)/对照组A560值×100%。

1.2.4细胞凋亡检测 取处于对数期的Huh-7细胞，以1×106个细胞接种于培养皿，培养24 h细胞贴壁后，加入毛花苷C，使其终浓度为0.003 2、2 mg·L-1，加等体积嘧啶作为对照组。待毛花苷C作用48 h后，消化细胞，收集细胞悬液并离心，弃上清，D-PBS重悬清洗1次，离心弃上清液，1×Annexin V Binding buffer重悬细胞，并吹打混匀，加入10 μL Annexin V/FITC和10 μL PI染色液(20 mg·L-1),避光染色30 min。300目筛网过滤细胞悬液，使用流式细胞仪测定并采集数据[8]。并通过激光共聚焦显微镜采集加入毛花苷C 48 h后，以及相应对照组Annexin V/FITC及PI染色图像，FITC检测波长为510～550 nm。

1.2.5Western blot检测 将Huh-7细胞室温消化后接种于培养皿中，24 h贴壁后，加入毛花苷C，使其终浓度为0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，加等体积嘧啶作为对照组，作用48 h后收集细胞，采用RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，再在蛋白样品中加入上样缓冲液混匀后，95℃金属浴10 min，冰上放置10 min后，保存于-20℃冰箱备用。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白样品，转移至NC膜上，5%脱脂奶粉(TBST配制)室温摇床封闭1.5 h，4℃孵育一抗过夜，TBST洗膜5次，每次10 min，室温孵育二抗1.5 h，TBST洗膜5次，每次5 min，与ECL发光液反应2～3 min后，X线片曝光、显影、定影，采用Gel-Pro Analyzer图像分析系统计算分析X线片吸光度值。

2 结果

2.1毛花苷C抑制Huh-7细胞增殖Tab 1的CCK-8实验结果显示，在加入毛花苷C后3 d，可发现毛花苷C对Huh-7细胞增殖的抑制作用随着药物浓度的增加而明显增强。加药5 d时，Huh-7细胞生长抑制率分别为(3.86±1.45)%、(8.64±1.43)%、(14.11±4.87)%、(79.72±2.23)%、(84.27±0.04)%。其中，0.003 2 mg·L-1毛花苷C组与对照组相比，无明显差异(P>0.05)；0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1毛花苷C组与相应对照组相比，呈现明显差异(P<0.05)。

2.2毛花苷C抑制Huh-7细胞克隆形成Fig 1的克隆形成实验结果显示，毛花苷C对Huh-7细胞克隆形成具有明显的抑制作用(P<0.05)，随着毛花苷C浓度增高，Huh-7细胞克隆抑制率随之增大。0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1的毛花苷C干预Huh-7细胞10 d后，克隆抑制率分别为(3.29±2.84)%、(19.41±2.66)%、(56.08±3.66)%、(69.03±1.81)%、(65.02±1.12)%。其中，0.003 2 mg·L-1毛花苷C组与对照组相比无明显差异(P>0.05)，0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1毛花苷C组较对照组表现出明显差异(P<0.05)。

2.3毛花苷C促进Huh-7细胞凋亡取对数生长期的Huh-7细胞，给予不同浓度的毛花苷C培养48 h后，离心收集细胞，以Annexin-V/PI双重染色后，使用流式细胞仪分析。如Fig 2A、2B所示，2 mg·L-1毛花苷C组与对照组晚期凋亡细胞(Q2)分别为(12.03±1.09)%、(6.97±0.25)%，早期凋亡细胞(Q4)分别为(7.63±0.61)%、(1.50±0.14)%，差异明显(P<0.01)。通过激光共聚焦显微镜观察(Fig 2C)，发现2 mg·L-1毛花苷C组Annexin-V染色(绿色荧光)高于对照组。

Tab 1 Lanatoside C inhibited hepatocellular Huh-7 cell proliferation

*P<0.05vscontrol

Fig 1 Lanatoside C inhibited hepatocellularA:Different concentrations of lanatoside C inhibited clonal proliferation of Huh-7 cells; B: Comparison of different concentrations of lanatoside C inhibiting Huh-7 cell clonal formation(A560 nm).*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.4毛花苷C促进Huh-7细胞凋亡蛋白caspase-7的活化不同浓度毛花苷C干预Huh-7细胞48 h后，Fig 3蛋白免疫印迹结果显示，毛花苷C可以明显促进Huh-7细胞caspase-7蛋白从35 ku全长蛋白形式，活化为18 ku活性蛋白形式，对照组caspase-7蛋白并未出现明显活化。

3 讨论

2000年，Haux等[9]对9 271例使用洋地黄治疗的患者进行分析，虽未发现该化合物具有明显的抗癌作用，但血药浓度高能降低患白血病和尿道癌风险，为强心苷的抗癌作用研究提供了基础，现已有上千篇报道强心苷类化合物体外抗癌特性的论文发表。

强心苷类物质抗癌机制包括抑制Na+/K+-ATP酶活性、抑制缺氧诱导因子1活性、抑制成纤维细胞因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)和NFκB、抑制拓扑异构酶的活性、阻断ER、诱导细胞凋亡等[10]。而化疗药物引起癌细胞死亡的关键机制为诱导细胞凋亡，caspase是参与细胞凋亡的主要蛋白酶。Badr等[11]在人恶性胶质瘤细胞研究发现，毛花苷C可激活caspase蛋白的表达，从而诱导其发生凋亡。Caspase最初以酶原存在于细胞中，当起始凋亡蛋白酶如caspase-8、caspase-9通过低聚反应而激活时，进一步激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等效应凋亡蛋白酶，从而导致与凋亡表型相关的一系列生物化学及形态学变化[12]。

Caspase可通过外源性途径及线粒体内源性途径激活[13]，当FasL与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)分别与细胞膜上的死亡受体Fas及肿瘤坏死因子受体TNFR发生特异性结合，随即引发死亡诱导信号复合体(death-inducing signaling complex，DISC)的形成，DISC募集caspase-8，并促进下游的caspase酶原激活。而内源性途径则是由各种细胞内外应激如癌基因的活化、DNA损伤、细胞缺氧等引起[14]。在内源性凋亡途径中，激活后线粒体外膜通透性增加，从而使细胞色素C及其他促凋亡因子由线粒体向胞质释放，这一过程主要受Bcl-2蛋白家族调控。Bcl-2蛋白家族的Bak、Bax等激活后，与线粒体外膜受体结合，在线粒体膜上形成孔道，使线粒体内部一些大分子蛋白如Smac/DIAB-LO、HtrA家族成员Omi/HtrA2以及细胞色素C由孔道释放到细胞质中，细胞色素 C上存在caspase活化因子1(Apaf-1)特异性结合位点，Apaf-1与之反应后，诱导别构效应而激活[15]，Apaf-1上具有与caspase-9同源的caspase募集与激活结合域(caspase raised and activating domain，CRAD)，活化的Apaf-1能够以CARD-CARD方式聚集并活化caspase-9，形成由细胞色素C、Apaf-1、caspase-9组成的凋亡小体，该凋亡小体可激活caspase-7，进而诱导下游蛋白的降解，最终引起细胞凋亡。在本实验中，采用不同浓度的毛花苷C干预肝癌Huh-7细胞，结果显示，毛花苷C能明显抑制Huh-7细胞增殖，促进Huh-7细胞凋亡，增强caspase-7的活化水平。提示毛花苷C诱导细胞Huh-7发生凋亡可能与细胞内源性凋亡途径有关，具体作用机制尚不明确，需要进一步实验进行证实。

Fig 3 Lanatoside C up-regulated activationof caspase-7 in Huh-7

(致谢：本实验在桂林医学院科学实验中心完成，感谢对本课题研究给予帮助的老师和同学。)