BMP9对裸鼠非小细胞肺癌骨转移的影响

王 静，刘 芳，杨晓琼

(重庆市红十字会医院/江北区人民医院检验科 400020)

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中85%左右为非小细胞肺癌，其病死率在肿瘤中位居首位；尽管手术及放化疗对治疗肺癌有很大帮助，但由于大多数肺癌患者初次发现时已属中晚期，发生了远处转移。而远处转移最常见的是骨转移，特别是溶骨性转移，因此导致患者错过了最佳治疗时机，故其五年生存率仍然很低[1-3]。此外，近年来由于靶向药物带来耐药问题也逐渐增多，因此，寻找新的分子标志物对肺癌的诊断和治疗有着至关重要的作用[4]。

骨形态发生蛋白(BMPs)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族中的一员，通过调节细胞的分化、增殖、凋亡等生物学活性参与组织器官的形成和发展，特别是骨或软骨形成的关键因子[5]。近年来，不少研究报道BMPs对肿瘤生长和转移的影响尤为重要。已有研究显示BMPs家族中BMP2、BMP7等在肺癌的生长转移中也有重要的作用[6-7]，而BMP9作为BMPs中促成骨作用最强、发现较晚的一员，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中多有报道[8-9]，而对肺癌生长和转移的影响还未见报道。本课题组前期检测出BMP9在正常支气管上皮细胞的中表达高于非小细胞肺癌细胞；肺癌细胞过表达BMP9后，其增殖、迁移、侵袭能力降低，凋亡能力增加；A549细胞与骨髓基质细胞HS-5共培养后，A549细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强，而BMP9抑制了这一作用，其机制可能与MAPK/ERK和NF-κB信号通路的激活有关[10-11]。但前期裸鼠皮下成瘤实验中未发现肿瘤转移到肝脏、肺或骨等其他器官，因此对肺癌骨转移方面的动物实验还需进一步的研究。本研究采用裸鼠胫骨外贴骨处注射肺癌细胞构建胫骨转移模型，探讨BMP9对肺癌骨转移的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人肺腺癌细胞A549购自美国菌种保藏中心(ATCC)。表达绿色荧光蛋白的空载腺病毒AdGFP和AdBMP9由美国芝加哥大学何通川教授惠赠。采用重庆医科大学动物实验中心提供16只4～6周龄雄性非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)裸鼠构建肺癌裸鼠胫骨转移模型。

1.2试剂和仪器 DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；聚合酶链式反应(PCR)引物由上海百力格公司合成；蛋白裂解液购自上海碧云天公司；兔抗BMP9抗体购自美国Abcam公司；鼠抗β-actin抗体、山羊抗鼠(或抗兔)IgG购自北京中杉金桥公司；碱性磷酸酶(AKP)染液购自南京建成科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养和病毒感染 A549细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃，5% CO2条件下培养，当细胞密度达90%左右时，用胰酶消化并传代。病毒感染时，待细胞生长密度达70%，每孔加入6 μL聚凝胺和重组腺病毒；24 h后，荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，以感染30%细胞的病毒量为合适的滴度。

1.3.2qRT-PCR检测细胞中BMP9基因 收集腺病毒感染或未感染的A549细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录后的cDNA进行PCR扩增，PCR反应体系为10 L，引物序列及产物长度见表1，PCR反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃、10s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40个循环；72 ℃，10 min。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞中BMP9蛋白 收集腺病毒感染或未感染的A549细胞，提取总蛋白，与蛋白Buffer混匀后，沸水中煮10 min，至蛋白变性。取50 μg蛋白样品，4 ℃进行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳、湿转、封闭，一抗孵育过夜(抗体稀释比例：BMP9，1∶500；β-actin，1∶1 000)、洗膜、二抗37 ℃育1 h、洗膜、显影，用Quantity One软件对条带进行分析。

1.3.4构建肺癌裸鼠胫骨转移模型 收集腺病毒感染或未感染的A549细胞，150 μL磷酸盐缓冲液(PBS)中重悬，冰上放置备用。实验分为4组：PBS对照组，A549组(6×106)，A549/GFP组(6×106)，A549/BMP9组(6×106)。将16只裸鼠随机分为4组，每组4只。将准备好的细胞悬液注射到裸鼠胫骨外贴骨处。定期观察裸鼠后肢胫骨肿瘤生长情况，6周后麻醉裸鼠，到重庆医科大学附属第一医院放射科对裸鼠胫骨行X线检查；之后处死裸鼠，取出胫骨组织，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙、包埋。

1.3.5苏木精-伊红染色(HE染色) 石蜡组织切成5 μm厚度，烤片过夜，经脱蜡及水化(依次为二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→蒸馏水)，HE染色，盐酸酒精分化，脱水及透明(依次为70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ)，封片，照相。

1.3.6AKP染色 石蜡组织切片、二甲苯脱蜡，水化(依次为95%乙醇→75%乙醇→30%乙醇→蒸馏水)，将玻片放入基质液染缸中，37 ℃孵育15 min，不要水洗，移至显色液A染色5 min，显色液B染色30 s，再放入复染剂中染色30 s，水洗30 s，甩干，镜检。染色呈现灰黑色颗粒或块状则为阳性。

2 结 果

2.1A549细胞中BMP9的基因和蛋白水平表达 分别将AdGFP和AdBMP9感染A549细胞，24 h后感染效率为80%以上。提取各组细胞做BMP9基因和蛋白水平检测，qRT-PCR及Western blot结果显示，A549细胞感染AdBMP9后，BMP9的基因和蛋白表达水平较阴性对照组明显上调(P<0.001)，由此证实BMP9在A549细胞中成功过表达。见图1、2。

图1 qRT-PCR检测细胞中BMP9基因表达情况

图2 Western blot检测细胞中BMP9蛋白表达情况

2.2BMP9抑制肺癌细胞A549的胫骨转移情况 胫骨外贴骨处注射肺癌细胞3周左右，裸鼠胫骨周围瘤体的大小有明显差异；6周后麻醉裸鼠行X线成像，PBS对照组骨组织完整，无肌肉肿胀等情况发生，A549组和A549/GFP组肺癌细胞浸润到裸鼠骨组织及周围软组织，裸鼠后肢明显增粗，其直径为阴性对照组的3～4倍，发生了明显的肿瘤侵袭和骨质破坏，A549/BMP9组骨及周围软组织损坏区域和损害程度较对照组明显减少。

2.3BMP9抑制肺癌对胫骨溶骨损害情况 肺癌发生骨转移最常见的类型是溶骨性转移，对骨造成了严重的损害。处死已照X线片的裸鼠，取出胫骨组织脱钙，做HE染色和AKP染色。HE染色显示，A549组和A549/GFP组胫骨髓腔中有明显的肿瘤细胞浸润，周围骨质已不完整，并且有的裸鼠胫骨骨髓已完全被肿瘤组织占据，而A549/BMP9组中髓腔破坏较轻。AKP是成骨发生中一个重要的标志，本研究显示，A549组和A549/GFP组骨质溶解破坏严重，髓腔被大量肿瘤细胞浸润，染色偏红色，其AKP阳性率为40%，而A549/BMP9组大多为完整骨组织，AKP染色呈灰黑色，阳性率为75%，明显高于对照组。见图3。

注：A为PBS对照组；B为A549组；C为A549/GFP组；D为A549/BMP9组

图3 BMP9抑制了肺癌细胞对胫骨的溶骨损害(HE,×100)

3 讨 论

肺癌成为全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其主要原因是容易发生转移，特别是溶骨性转移，严重影响患者的预后，成为治疗肺癌最大的阻碍，因此寻找新的分子标志物对于早期诊断和治疗肺癌，延缓骨转移的破坏作用至关重要。

BMPs在胚胎期肺和支气管的发育过程中有非常重要的作用[12-13]，目前对BMPs在肺癌中的研究也逐渐增多，不同亚型的BMP在不同类型的肺癌组织中表达和作用不同[14-16]；如BMP2肺癌中过表达，促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力；BMP3b在非小细胞肺癌中低表达；BMP4可负向调控肺癌细胞的生长，促进肺腺癌细胞A549的衰老；BMP5的mRNA和蛋白水平在肺腺癌细胞中的表达较肺鳞癌细胞中高；BMP7可促进肺癌细胞的迁移和侵袭，但对其增殖和凋亡并没有影响[17-19]。由此可见，BMPs在肺癌中的作用尤为重要，值得深入探究。成骨作用强的BMP9在其他肿瘤中有重要的作用，而在肺癌中报道较少。

基于前期实验检测出BMP9在体外抑制了肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与MAPK/ERK和NF-κB信号通路的激活有关。本研究采用裸鼠胫骨外贴骨注射肺癌细胞构建胫骨转移模型，结果显示，注射A549细胞6周后，PBS对照组、A549/GFP组裸鼠胫骨周围瘤体明显大于A549/BMP9组；肺癌细胞浸润到裸鼠骨组织，发生了明显的侵袭和骨质破坏溶解，AKP染色面积和强度减少，而A549/BMP9组骨损坏区域和溶骨程度明显减少。此研究进一步证实了BMP9对肺癌细胞增殖、转移的抑制作用。

综上所述，BMP9可在体内外抑制非小细胞肺癌的增殖和转移能力，但其在临床肺癌患者不同分型的肺癌组织及癌旁组织是否有差异，还需收集大量的临床标本验证，为肺癌的临床诊断和治疗提供更多理论基础。