显微镜观察药物敏感性技术在菌阴肺结核中的诊断价值

付佑辉，张 舒，池 峰，李 挺，范艳红，生淑红

(上海市第七人民医院呼吸内科 200137)

结核病是危害人类健康重大传染病之一。在我国，菌阴肺结核患者数占活动性肺结核患者总数的73.5%，如何提高这类患者的病原学检出率，并有效、快速地作出早期诊断，对肺结核的诊治、防控具有十分重要的作用[1]。支气管肺泡灌洗液(BALF)是利用支气管镜对相应病变部位的肺段或亚段灌注一定量的无菌生理盐水后回吸采集的肺泡表面衬液。对不容易留取或干咳无痰的患者进行经支气管镜肺泡灌洗术，更接近病灶采集样本，可以有效提高病原体检出率。显微镜观察药物敏感性检测技术(MODS)是近年来报道的一种新的结核分枝杆菌检测技术，具备快速、简便、灵敏、价廉等优点[2-3]。本研究将MODS应用于菌阴肺结核患者肺泡灌洗液中结核分枝杆菌(MTB)的检测，将其与肺泡灌洗液罗氏培养法、抗酸染色涂片法的结果进行对比，并对其在菌阴肺结核中的临床诊断价值初步进行评价。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2013年1月1日至2016年12月31日本院结核科门诊就诊的90例菌阴肺结核患者的肺泡灌洗液标本，以及60例呼吸科住院的非肺结核肺部疾病(包括慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张、肺癌等)患者的肺泡灌洗液标本。其中菌阴肺结核诊断标准参照《肺结核诊断和治疗指南》[4]执行。

1.2试剂与仪器 对硝基苯甲酸(PNB)购自Sigma公司。其储存液的制备方法：将PNB纯药粉溶解在0.1 mol/L氢氧化钠中，再取0.1 mol/L盐酸溶液调pH至6.5；加无菌蒸馏水制成5 mg/mL储存液，然后将上述配置好的储存液用无菌滤膜过滤、分装，-20 ℃保存。应用时取出，常温下溶解，倍比稀释，配置成2倍于终浓度为800 μg/mL(即浓度为1 600 μg/mL)的工作液。液体培养基的干粉为Middlebrook 7H9(购自美国Difico公司)，营养添加剂OADC(购自Becton Dickinson公司)。配置含10%营养添加剂的Middlebrook 7H9液体培养基为应用液。具体配置方法按文献[2]进行。罗氏培养基和鉴定培养基按《结核病诊断实验室检验规程》制备[5]。MTB标准菌株(H37Rv，ATCC 25177)购自国家菌种保藏中心。所用仪器包括倒置显微镜(XDS-1B 重庆光电仪器有限公司)和24孔细胞培养板(TPP，瑞士进口)。

1.3方法 患者的BALF标本采集方法如下：根据患者的胸部CT资料，选择支气管肺段病变部位作为灌洗的位置，然后将10～25 mL生理盐水通过支气管镜灌入支气管肺段的相应部位；然后通过负压(压力为25～100 mm Hg)吸引BALF至瓶中。此操作可以重复灌洗2～3次，收集BALF为15～20 mL左右。

1.3.1MODS培养法 将150例患者肺泡灌洗液化去污染处理(方法参见文献[5])后的沉淀，用液体培养基洗涤2遍，用6 mL液体培养基重悬。运用MODS技术进行检测并同步将其接种至罗氏培养基进行培养和鉴定。操作如下：每块24孔细胞培养板做11份肺泡灌洗液样本，每块作为检测的24孔细胞培养板共设置11个检测孔、11个鉴别孔及2个阴性对照孔。首先将0.4 mL无菌的液体培养基分别加入到11个检测孔、在11个鉴别孔内分别加入0.4 mL配制PNB工作液；在2个阴性对照孔中加入0.4 mL的无菌液体培养基和0.4 mL无菌生理盐水，然后将0.4 mL肺泡灌洗液样本沉淀悬浊液分别加入到检测孔和鉴别孔内，混匀用胶带密封，放置密封的塑料袋内，然后将密封好的细胞培养板置入37 ℃孵箱内进行培养。从放入孵箱后的第3天起用倒置显微镜进行观察(×10目镜，×40物镜)，每天观察1次，第15天后每周观察2次，至第40天结束。若在检测孔内观察到呈索状结构生长的细菌，含PNB鉴别孔无细菌生长，则说明该样本中有MTB生长；若检测孔及含PNB鉴别孔内均观察到呈索状结构生长的细菌，则说明样本中有非MTB生长；若鉴别孔及检测孔内均未观察到呈索状结构生长的细菌，则分别从检测孔及鉴别孔中吸取少量标本液，进行抗酸染色涂片镜检，如抗酸染色涂片结果为阳性，可判断该样本为无索状结构的非MTB；如抗酸染色涂片结果为阴性，则可判断该样本中无分枝杆菌生长；如阴性对照孔出现细菌生长，判断为污染。每批样本检测以H37Rv为质控株(具体方法参见文献[6])。

1.3.2罗氏培养和鉴定 取经前处理后肺泡灌洗液标本0.1 mL无菌接种于罗氏培养基斜面上，将每份标本同时接种在2支罗氏培养基、1支含PNB罗氏培养基(PNB药物浓度为500 mg/mL)及1支含噻吩-2-羧酸肼(TCH)罗氏培养基(TCH药物浓度为5 mg/mL)上，放37 ℃温箱孵育，具体方法操作参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]执行。

1.3.3涂片抗酸染色 用接种环挑取肺泡灌洗液0.1 mL，于玻片正面右侧2/3中央处均匀涂抹成10 mm×20 mm左右椭圆形灌洗液膜，将灌洗液膜静置自然干燥后进行抗酸染色，具体方法操作参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]执行。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件对数据进行处理。偏态分布的计量资料以中位数和四分位数间距[M(P25，P75)]表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher′s确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1MODS与罗氏培养法所需时间比较 应用MODS对150例患者肺泡灌洗标本中MTB进行检测，阳性检出时间为5～28 d，中位时间为[11.0(7.5，18.5)]d，而罗氏培养法检测时间为12～48 d，中位时间为[20.0(14.9～34.9)]d，MODS检测时间短于罗氏培养法，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 MTB特征性索状结构(×40物镜)

2.23种方法检测结果比较 在90例临床确诊为菌阴肺结核患者的肺泡灌洗液样本中，抗酸染色涂片法、罗氏培养法及MODS检测的MTB阳性分别为20例(22.2%)、30例(33.3%)和46例(51.1%)，阳性率比较差异有统计学意义(χ2=16.68，P<0.001)。60例非结核的肺部疾病患者肺泡灌洗液样本检测的假阳性结果分别为2例(3.3%)、2例(3.3%)和1例(1.7%)，假阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.54，P>0.05)。90例临床确诊为菌阴肺结核患者肺泡灌洗液样本的检测结果表明，MODS与传统罗氏培养法结果符合率为71.1%，如以罗氏培养法为判断标准，则MODS检测MTB的灵敏度为83.3%(25/30)、特异性65%(39/60)、阳性预测值(PPV)54.3%(25/46)、阴性预测值(NPV)88.6%(39/44)、正确性为71.1%(64/90)；MODS与罗氏培养法结果进行比较，差异有统计学意义(χ2=6.52，P<0.05)。MTB在液体培养基中生长所呈现的特征性索状结构见图1。

3 讨 论

菌阴肺结核是指3次痰涂片和1次痰培养检查MTB均为阴性的肺结核患者。在我国肺结核患者中，有50%～70%的患者为菌阴肺结核。由于菌阴肺结核患者痰里面找不到MTB，因此它的诊断缺乏“金标准”，给诊断带来困难，临床上很容易发生漏诊、误诊、漏治、误治、甚至过治，这样不仅给患者增加了经济、心理负担，也给社会带来一定负担和危害。因此，如何对菌阴肺结核进行快速、准确地诊断，一直是临床急需解决难题之一。实际上，结核病患者，甚至无临床表现的结核潜伏感染者体内都应存在MTB。这是结核病发病首要及必须的条件。就细菌学而言，不存在所谓的“菌阴”肺结核，只是限于采用常规方法未能从痰标本检出分枝杆菌而已。因此，菌阴肺结核不是一个固定的概念，它受检测技术灵敏度、特异度的限定。为此，寻找快速、敏感、特异、准确的结核病细菌学诊断新技术，对菌阴肺结核的诊治将具有十分重要的意义。2000年，有研究者建立了一种结核病细菌学诊断新技术——MODS，通过倒置显微镜对MTB的特征性索状结构进行观测，来确定是否有MTB生长[3]。该技术具有快速、简便、价廉等特点。随后，有研究将其用于结核病的快速诊断，显示出良好的应用前景[7-9]。

本研究通过应用MODS检测肺泡灌洗液中MTB，探讨其对菌阴肺结核的诊断价值，国内外相关文献较少。本研究选择肺泡灌洗液样本主要原因有：(1)BALF是通过支气管镜将无菌生理盐水灌注至病变部位直接获取，这样不但能获取较大数量细菌，而且一定程度上避免了口咽部细菌对标本的污染；(2)对于支气管镜不能到达的远端病灶，BALF可根据影像学提示的病灶位置，通过支气管镜灌注生理盐水后的冲洗作用，在一定程度上引出远端病灶结核杆菌，这样增加样本MTB的获得概率；(3)通过支气管镜检查的激发、冲洗作用，可疏通、引流病灶的支气管，从而提高样本MTB的获得概率。本研究纳入的所有菌阴肺结核组患者的诊断标准均严格参照2001年中华医学会结核病学分会制定的菌阴肺结核的诊断标准执行，具有较高的可信度和可比性[4]。笔者将两组患者肺泡灌洗液进行MODS检测的同时，还将其与传统的抗酸染色涂片法和罗氏培养法的检测结果进行了比较，研究结果表明MODS检测肺泡灌洗液中MTB的阳性检出率显著高于涂片法和罗氏培养法(P<0.05)，罗氏培养法是目前公认简便的结核病诊断的“金标准”，如以它为判断标准，MODS法具有较高的灵敏度(83.3%)，但总体的阳性检出率、检测时间中位数、特异度与WALUSIMBI等[9]报道的数据相比偏低，可能与选用的肺泡灌洗液样本多数来自治疗后的菌阴肺结核患者有关，其服药后肺泡灌洗液中可能有大量死菌存在，或者细菌活力较低。

综上所述，将MODS用于肺泡灌洗液样本中MTB的检测，只需支气管镜、孵箱及显微镜就能进行检测，操作简便、检测成本低廉[10]，可以满足临床对MTB快速检测的需求，加上本法检测的是活菌，因此可作为菌阴肺结核细菌学快速检测的新方法之一，具有良好应用前景。