HPLC-PDA法同时测定硫酸新霉素可溶性粉中非法添加4种化学药物

熊 玥，宋慧敏，汪云花，孙 瑶，石慧慧

（江苏省兽药饲料质量检验所，南京210036）

硫酸新霉素为氨基糖苷类抗生素，其制剂硫酸新霉素可溶性粉临床上主要用于治疗禽敏感的革兰氏阴性菌所致的胃肠道感染，是常见的兽用处方药［1］。甲硝唑为硝基咪唑类抗原虫药，用于牛毛滴虫病、肠道原虫病等，亦可广泛用于厌氧菌所致感染［2］。水杨酸是一种脂溶性的有机酸，具有中等程度的抗真菌作用［2］。乙酰甲喹为喹啉类药物，具有广谱抗菌活性，主要用于密螺旋体所致的猪痢疾和细菌性肠炎［2］。甲氧苄啶为广谱抗菌药，对多种革兰氏阳性菌及阴性菌均有抗菌作用，一般不单独做抗菌药使用，常作为增效剂与磺胺药联合应用［3］。目前市场上一些不法兽药生产企业为提高竞争力，常在制剂中非法添加一种或多种处方外化学药物以达到提高治疗效果的目的，给畜禽养殖业带来了安全隐患。农业农村部已加大了对兽药处方外非法添加的监管与打击力度，从2015年开始实施鉴别抽检和摸底抽检［4］，近年来又陆续发布了多个兽药处方外非法添加物检查的公告作为检验依据。近期，在进行非法添加常规筛查时［5］，发现两批硫酸新霉素可溶性粉供试品图谱中出现多个响应值较高的未知色谱峰，对比前期收集的化合物紫外光谱特征图，疑似检出处方外成分甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶。本文建立了同时测定硫酸新霉素可溶性粉中非法添加甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶的高效液相色谱法，对疑似阳性样品进行了确证，方法简单可靠，从而为非法添加检测方法研究提供了新的实验方法及数据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters Arc高效液相色谱仪配2998 PDA二极管阵列检测器和Empower 3色谱工作站软件（美国Waters公司）、XS105DU型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、FE20型pH计（瑞士Mettler Toledo公司）、KQ-300DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂

1.2.1 试剂 甲醇、三乙胺均为色谱纯（美国Merck公司）；磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯（南京化学试剂有限公司）；水为超纯水。

1.2.2 对照品 甲硝唑对照品（含量：100.0%，批号：100191-201507，中国食品药品检定研究院）、水杨酸对照品（含量：99.3%，批号：100106-201605，中国食品药品检定研究院）、乙酰甲喹对照品（含量：99.6%，批号：H0111505，中国兽医药品监察所）、甲氧苄啶（含量：99.9%，批号：100031-201205，中国食品药品检定研究院）。

1.2.3 供试品

1.2.3.1 硫酸新霉素可溶性粉制剂空白 经检验不含甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶的企业报批产品，批号为 16101709，规格为 100 g：32.5 g（325万单位）。

1.2.3.2 疑似阳性样品 两个样品均为2017年度国家兽药风险监测抽检的产品，其中硫酸新霉素可溶性粉样品 A，标称河北某企业生产，批号为

20151004，规格为 100 g：3.25 g（325 万单位）；硫酸新霉素可溶性粉样品B，标称福建某企业生产，批号为 20151201，规格为 100 g：6.5 g（650 万单位）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 mL，用氢氧化钠试液调节 pH 值至 7.0）-甲醇（70：30）为流动相，流速：1.0 mL／min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，二极管阵列检测器，采集波长范围为200～400 nm，分辨率

1.2 nm，记录230 nm波长处的色谱图。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液制备 取供试品 1.0 g，置 50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理15 min，静置，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。取滤液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.2 混合对照品储备液及系统适用性溶液制备

分别取甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶对照品各25 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1 mg／mL的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.1 mg／mL 的系统适用性溶液。

2.2.3 硫酸新霉素可溶性粉制剂空白溶液制备取硫酸新霉素可溶性粉制剂空白 1.0 g，照 2.2.1 项下操作制成硫酸新霉素可溶性粉制剂空白溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性及系统适用性考察 精密量取硫酸新霉素可溶性粉制剂空白溶液10 μL，照2.1项下色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图及光谱图。另取系统适用性溶液10 μL，同法操作。结果表明制剂空白溶液在4种被测物甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶相应的出峰位置处不产生干扰，说明方法的专属性强；4种被测物色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度良好，说明所选试验条件满足测定要求（图1、图2）。

图1 硫酸新霉素可溶性粉制剂空白溶液光谱指数图Fig 1 Chromatogram and spectorgram of blank solution

图2 系统适用性溶液光谱指数图Fig 2 Chromatogram and spectrogram of system suitability solution

2.3.2 线性 精密量取混合对照品储备液 1、1、1、2、1、3 mL 分别置于 100、50、25、25、10、25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.12 mg／mL 的标准曲线溶液，照2.1项下色谱条件测定。按峰面积与对应的浓度作标准曲线，并计算回归方程和相关系数。甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶对照品的回归方程及相关系数见表1。结果表明4种被测物在0.01～0.12 mg／mL浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

表1 4种被测物的回归方程、相关系数、线性范围、检测限Tab 1 Calibration curves， correlation coefficients， linear ranges， limits of detection of 4 drugs

2.3.3 准确度 以硫酸新霉素可溶性粉制剂空白加甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶对照品做回收率试验来考察方法的准确度。回收率试验溶液配制：取硫酸新霉素可溶性粉制剂空白1.0 g，另精密称取4种对照品各20 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理15 min，静置，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。取滤液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制上述试验溶液各6份。精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，照2.1项下色谱条件测定。结果显示：甲硝唑回收率为 98.6%，RSD 为 0.4%；水杨酸回收率为98.0%，RSD为0.7%；乙酰甲喹回收率为99.4%，RSD 为 0.7%；甲氧苄啶回收率为 99.9%，RSD为1.0%，均符合方法学要求。

2.3.4 检测限 参考文献方法［6］配制不同浓度的加标溶液，分析所得色谱图及光谱图，以光谱图失真的最大浓度作为方法的检测限［3］。取硫酸新霉素可溶性粉制剂空白1.0 g，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理15 min，静置，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。取滤液1.0 mL，置25 mL量瓶中，平行操作5份，分别精密加入系统适用性溶液（0.1 mg／mL）适量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL），加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取上述检测限样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，照2.1项下色谱条件测定检测限，该色谱条件下甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶在硫酸新霉素可溶性粉中的检出限见表1。

2.3.5 耐用性 从柱温、流动相pH值、色谱柱三个方面考察检测方法的耐用性。调节柱温为25、30、35℃，结果表明：随着柱温升高，4种被测物保留时间均有所提前；调节流动相pH值为6.5、7.0和7.5，结果表明：在所调节范围内，4种被测物保留时间、光谱图差别不大；选择三款不同品牌色谱柱（资生堂 MG，250 mm×4.6 mm，5 μm；Waters Atlantis T3，250 mm×4.6 mm，5 μm；Waters SunFire C18，150 mm×4.6 mm，5 μm），考察不同色谱柱对检测的影响，在所建检测方法条件下，三种品牌色谱柱所得色谱峰的分离度、理论塔板数、对称因子均符合规定，方法耐用性较好。

2.4 疑似阳性供试品测定结果 取疑似阳性的硫酸新霉素可溶性粉样品照2.2.1项下方法制备成供试品溶液；取2.2.2项下系统适用性溶液作为建立对照品光谱数据库的溶液，分别精密量取上述试验溶液各 10 μL，照 2.1项下色谱条件测定。 用Empower 3色谱工作站软件建立对照品光谱数据库，并对供试品溶液的峰纯度和光谱匹配度进行计算。峰纯度检查结果：样品A与样品B色谱图中各峰的纯度角度均小于纯度阈值，结果表明样品A与样品B色谱图中各峰均为单一物质峰。光谱相似度检查结果：样品A色谱图中，与乙酰甲喹、甲氧苄啶对照品保留时间一致的色谱峰的光谱图及最大吸收波长分别与乙酰甲喹、甲氧苄啶对照品的光谱图及最大吸收波长保持一致，且匹配角度均小于匹配阈值，光谱相似，为同一物质；样品B色谱图中，与甲硝唑、水杨酸及乙酰甲喹对照品保留时间一致的色谱峰的光谱图及最大吸收波长分别与甲硝唑、水杨酸及乙酰甲喹对照品的光谱图及最大吸收波长保持一致，且匹配角度均小于匹配阈值，光谱相似，为同一物质。结合保留时间、峰纯度及光谱相似度检查结果，综合判定样品A中非法添加了乙酰甲喹及甲氧苄啶，样品B中非法添加了甲硝唑、水杨酸及乙酰甲喹。以2.2.2项下的系统适用性溶液作为对照进样，以外标法按峰面积计算含量，样品A中乙酰甲喹添加量约为150 g／kg，甲氧苄啶添加量约为60 g／kg。样品B中甲硝唑添加量约为102 g／kg，水杨酸的添加量约为 31 g／kg，乙酰甲喹添加量约为107 g／kg。实验结果见图 3、图 4和表 2、表3。

图3 样品A溶液光谱指数图Fig 3 Chromatogram and spectrogram of the sample A solution

图4 样品B溶液光谱指数图Fig 4 Chromatogram and spectrogram of the sample B solution

表2 峰纯度及光谱相似度检查结果表Tab 2 Results of peak purity test and spectral similarity test

表3 保留时间及紫外光谱结果表Tab 3 Results of retention time and UV absorprion spectra

3 讨论与结论

3.1 色谱条件的选择 本实验在非法添加初步筛查时，采用的是农业部公号2448号中黄芪多糖注射液非法添加解热镇痛类化合物检查方法［7］，使用的流动相盐浓度较高，故减少磷酸二氢钠与三乙胺的使用量，调整为以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠3.0 g，加水 1000 mL 使溶解，加三乙胺 0.5 mL，用氢氧化钠试液调节 pH 值至 7.0）-甲醇（70：30）为流动相，各色谱峰与相邻色谱峰之间分离度最小值为4，且峰形良好，理论塔板数均大于8000。硫酸新霉素化学结构不具备特征的紫外发色团，采用紫外检测器直接测定，供试品色谱图中并无色谱峰出现。综合考虑4种被测化学药品在该色谱条件下的最大吸收波长，选取230 nm作为检测波长，保证各峰面积大小合适，便于结果的判定。

3.2 测定用溶剂的选择 在非法添加高通量筛查工作中常以甲醇作为提取溶剂，且4种被测化学药物在甲醇中均溶解性良好，故选择甲醇作为提取溶剂。

3.3 检查方法的扩展使用 除硫酸新霉素可溶性粉外，当采用该检查方法用于其他兽药制剂的检查时，需进行空白试验和系统适用性试验，并测定方法的检出限，注意调整供试品溶液或对照品溶液的浓度，使两者目标分析物的峰面积尽量接近，以便于结果的判定。

3.4 兽药非法添加物检测标准展望 随着国家对农产品质量安全的日益重视，农业农村部对兽药处方外非法添加的监管与打击力度也不断加大，近年来发布了多批公告作为兽药处方外非法添加物检查的检验依据，但相关标准的制修订还跟不上少数企业非法添加的步伐。如本实验中涉及的硫酸新霉素可溶性粉样品，目前并无与之相关的非法添加检验方法公告发布，兽药中非法添加水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶已有多篇文献报告，且农业农村部公告中已有检测方法发布，但兽药中非法添加甲硝唑，则既无文献报道亦无公告发布，需要引起有关部门的重视。农业农村部应进一步加快兽药中非法添加检测方法的制修订工作，为严厉打击非法添加违法行为提供依据。

本研究建立了HPLC-PDA法同时测定硫酸新霉素可溶性粉中非法添加甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶的方法，方法简便、专属性强，为兽药市场的安全监管提供了一定的技术支撑。