木瓜蛋白酶提取三文鱼鱼皮油的工艺研究

李平，曹璐蕾，毛相朝

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛266003)

三文鱼(Salmosalar)，属硬骨鱼纲鲑形目鲑科，肉质鲜美，蛋白质含量高，深受消费者喜爱，是当今世界范围内的高档水产消费品[1]。在三文鱼的加工处理过程中，通常分离出鱼肉后，产生约50%的废料，如鱼皮、内脏、鱼头等，但并未得到有效的利用[2]。其中，鲑鱼皮的含油量在23.32%～61.53%(以干重计)，具有较高的利用价值[3]。鲑鱼皮油中多不饱和脂肪酸含量丰富，尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，它们不仅是构成动物细胞的重要成分，还具有多种生理功能，比如防止动脉粥样硬化，降血压，改善糖尿病、炎症、癌症等[4]，对人类健康大有益处。

油脂提取的常用方法主要有压榨法、蒸煮法、溶剂法、淡碱水解法、超临界流体萃取法及酶法等。其机理是通过各种物化作用，破坏含油组织的结构，加速油脂分子的热运动，降低其黏度和表面张力，使油脂从破坏了的组织中分离出来，随着乳胶体的破坏，油脂逐渐变得清澈透明[5]。压榨法和蒸煮法操作简便，但鱼油提取率较低。压榨法通常与酶法结合使用，以提高油的产出。溶剂法和超临界流体萃取法在提取油脂前需控制材料的含水量，而且残余溶剂含量和操作成本较高[6-8]。超临界流体萃取法设备运行维护比较困难，同时可能引入内源挥发性化合物而影响人体健康[9]。淡碱水解法中碱浓度不易控制，浓度过低则水解不完全，浓度过高则会引起鱼油皂化，均会降低鱼油的提取率[10]。酶法具有作用温和、时间短的特点，与热处理法相比，能够提高油的产量；与有机溶剂法相比，提取的极性脂质有更高含量的DHA[11]。Kechaou等[12]用碱性蛋白酶水解沙丁鱼内脏后，得到的脂质比有机溶剂法富含更多磷脂，营养价值高。此外，酶解液中含有可溶性蛋白，可用于蛋白质回收、功能性多肽或药物等研究，有利于提高原料的综合利用率。因此酶法提油的应用更为广泛。

通常，动物、植物和微生物来源的工业酶均可用于油脂的提取，比如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶和真菌蛋白酶等。蛋白酶具有良好的破乳效果，可水解界面蛋白质，使界面强度降低，从而促进油滴的聚结和絮凝[13]。臧丽芹等[14]利用碱性蛋白酶提取鳐(Rajiformes)的肝油，提取率可达86.46%。Zhu等[8]使用木瓜蛋白酶提取紫海胆(Anthocidariscrassispina)生殖腺脂质，脂质回收率为(82.0±2.1)%。此外，内源性蛋白酶在油脂的提取中也有较为广泛的应用[15]。于海宁等[16]采用木瓜蛋白酶结合自溶酶提取南极磷虾(Euphausiasuperba)油，其中EPA与DHA的质量之和占总脂肪酸的75.77%。然而，内源酶的自溶作用难以控制，受到多种因素的影响，比如鱼的种类、季节、酶的种类等。相比之下，使用外源酶更容易控制反应进程[11]。

据国际渔业协会报道，有20%～30%的粗鱼油被用于生产各种药品、食品，如多烯酸乙酯软胶囊、鱼油纳米乳、清凉饮料和豆奶等；大量的粗鱼油用作饲料添加剂，完善饲料营养，促进动物生长。由于天然鱼油中含有大量的不饱和脂肪酸，高DHA、EPA含量的甘油酯型鱼油产品具有良好的发展前景[17-19]。Mbatia等[6]和Linder等[20]为了得到高附加值的脂质产品，利用蛋白酶酶解尼罗河鲈(Latesniloticus)和三文鱼头，将提取的脂质用脂肪酶处理并进行再酯化，得到了富含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的甘油酯。为提高三文鱼皮的利用率，得到高附加值的三文鱼产品，实现其高值化利用，本研究以三文鱼加工后丢弃的鱼皮为材料，在筛选合适的水解蛋白酶基础上，通过单因素实验和正交实验优化酶解工艺，并对鱼油的品质进行了评估，旨在为拓展三文鱼皮及其废弃物在饲料和食品领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

三文鱼皮，购自青岛市盛隆伟业有限公司。木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶及胰蛋白酶均为生化试剂，购自北京索莱宝科技有限公司。石油醚、一氯化碘、氢氧化钾、碘化钾及硫代硫酸钠等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

主要包括：电子分析天平(Metteler Toledo公司，PL203)，pH计(上海精科仪器有限公司，PHS-2F)，匀浆机(九阳股份有限公司，JYL-C022E)，水浴锅(常州智博瑞仪仪器公司，HH-3A)，恒温水浴摇床(常州万顺仪器公司，SHZ-88)，高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂，TGL-20B)。

1.3 实验流程

三文鱼皮→切成小块→调节液固比(水∶原料)→用匀浆机搅匀→调节体系至一定的pH→加入蛋白酶→在一定温度下酶解一段时间→取出后放置于沸水中10 min灭活蛋白酶→4 000 r/min离心10 min→分离出鱼油并称重→计算提油率→鱼油品质评估。

1.4 基本成分的测定

将冷冻的三文鱼皮绞碎，采用直接干燥法(参照GB 5009.3—2016)测定水分含量，采用凯氏定氮法(参照GB 5009.5—2016)测定蛋白质含量，采用索氏抽提法(参照GB 5009.6—2016)测定粗脂肪的含量，采用马弗炉灰化法(参照GB 5009.4—2016)测定灰分含量。

1.5 最适蛋白酶的确定

蛋白酶活力的测定采用福林酚法，具体步骤参照GB/T 23527—2009。将一个酶活力单位(U)定义为在特定的条件下，每分钟每产生1 μg酪氨酸所需要的酶量。所用蛋白酶的最适温度和pH的测定方法为福林酚法，先在特定的pH环境中测定不同温度对酶活力的影响，确定最佳作用温度，此后在各自的最适温度下研究不同pH对酶活力的影响，以此确定最佳pH。在各酶最适作用条件下，添加相同的酶量(6×103U/g(以原料计)，调节液固比为1∶1，酶解鱼皮2.5 h，以鱼油的提取率为指标，确定最适的蛋白酶。

式(1)

1.6 木瓜蛋白酶提取三文鱼鱼皮油的单因素实验

将水与三文鱼的鱼皮按照液固比为1∶1的比例混合匀浆，加酶量为(2×103～1×104)U/g(以原料计，每个梯度间隔2×103U/g)，在60 ℃、pH 6.0条件下，酶解反应1.5 h。再于100 ℃水浴10 min，终止酶反应。然后于4 000 r/min离心10 min，将上层油脂取出，称取鱼油的质量，确定最佳加酶量。

在最佳加酶量的基础上，探究不同液固比对鱼油提取率的影响。将水与鱼皮按照液固比为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1的比例混合，进行酶解反应，确定最佳液固比。

按照上述实验测得的最佳加酶量和液固比，分别调节pH至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0进行酶解反应，确定最佳pH。

在最佳加酶量、液固比和pH条件下，于60 ℃对鱼皮酶解一定的时间(1～5 h)，确定最佳酶解时间。

按照上述实验测得的最佳条件，分别在55～75 ℃下进行三文鱼皮的酶解，研究酶解温度对提油率的影响。

1.7 正交优化试验

以单因素实验结果为基础，选择加酶量、pH、酶解温度和酶解时间4个因素，设计四因素三水平L9(34)试验，以鱼油提取率为指标，优化酶解工艺参数。根据正交试验的优化结果，在最优条件下利用木瓜蛋白酶提取三文鱼鱼皮油，并计算提油率。

1.8 鱼油理化指标的测定

粗鱼油的品质判定参照SC/T 3502—2016标准，鱼油中水分及挥发物含量的测定参照GB 5009.236—2016，酸价的测定参照GB 5009.229—2016，碘价的测定参照GB/T 5532—2008，过氧化值的测定参照GB 5009.227—2016，不溶性杂质的测定参照GB/T 15688—2008。

1.9 统计分析

每个试验重复3次，结果表示为(平均值±标准偏差)。数据统计分析采用SPSS 19.0，组间差异显著性分析采用ANOVA方差分析，P<0.05为有显著差异。

2 结果与分析

2.1 三文鱼鱼皮的基本成分

经测定，三文鱼皮中水分占52.0%；蛋白质含量较高，为26.7%；粗脂肪含量为18.8%，鱼油含量丰富；灰分含量为2.3%。三文鱼鱼皮蛋白质含量丰富、脂肪含量较高，可用于鱼粉的制作、调味品的研制及鱼油的提取等，是一种可利用的生物资源。

2.2 最适蛋白酶的确定

酶的种类及其作用条件对提油率有重要的影响，为确定蛋白酶的提油效果，首先对5种蛋白酶的最适作用条件进行了测定，结果见表1，并在各自最适条件下对蛋白酶的提油率进行评价。酶解后会出现四相，即油相、乳状液、水相、沉淀。由表1可得，在相同加酶量的条件下，木瓜蛋白酶的提油率明显高于其他4种蛋白酶，可达79%。中性蛋白酶和碱性蛋白酶的提油率在60%左右，胰蛋白酶的提油效果最差，绝大部分鱼油未得到充分的释放。因此，木瓜蛋白酶最适用于三文鱼鱼皮油的提取。Zhu等[8]使用水酶法提取紫海胆生殖腺脂质，所用酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶，温度及pH均根据酶的最适条件而定，水解3 h后，木瓜蛋白酶的脂质回收率最高，为(82.0±2.1)%。本研究结果与之一致，均是木瓜蛋白酶表现出最好的酶解效果，推测可能与木瓜蛋白酶的活性位点、酶解环境等有关。木瓜蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，切开点羧基侧是任一氨基酸残基的肽键[21]，具有很高的水解效率。鱼皮中胶原含量最高可占蛋白质总量的80%多，而木瓜蛋白酶在鱼皮的水解中有着广泛的应用，其可用于提取小分子量的胶原蛋白[22-23]。本研究中，随着木瓜蛋白酶的水解，与脂质相关的蛋白(如脂蛋白、蛋白质-脂质复合体)裂解程度高[15]，从而油脂易于被释放出来。

表1 五种蛋白酶的最适反应条件及提油率Tab.1 The optimal conditions for five proteasesand its oil extractability n=3

注：同列不同小写字母之间存在显著性差异(P<0.05)。

2.3 单因素试验

2.3.1 加酶量对鱼油提取的影响

在温度为60 ℃、pH 6.0条件下，分别添加2×103、4×103、6×103、8×103和1×104U/g(以原料计)木瓜蛋白酶，并测定三文鱼鱼皮油的提取率。从图1可知，随着酶量的增加，鱼油提取率也逐渐升高，当加酶量达到6×103U/g(以原料计)时，提取率达到最高。随着酶量的继续增加，提油率呈现出下降的趋势，这可能因为释放的脂质与肽或磷脂乳化降低了鱼油提取率。del Valle等[24]指出，水解度过高会导致乳状液形成，不利于脂质的释放。因此本实验确定6×103U/g(以原料计)为木瓜蛋白酶的最适添加量。

2.3.2 液固比对鱼油提取率的影响

将液固比分别设置为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，在酶解温度为60 ℃，加酶量为6×103U/g(以原料计)，pH为6.0条件下，酶解3 h。如图2所示，液固比过小时，几乎没有鱼油被释放，这可能是因为水分过少不利于鱼皮和蛋白酶在体系中的均匀分散和相互作用；液固比为1∶1时，鱼油提取率最高；随着液固比的增加，鱼油提取率有下降的趋势，这可能是由于加水量过多降低了反应体系中酶的浓度，底物与酶分子碰撞几率降低，结合程度下降，降低鱼油提取率。综合分析，选择在液固比为1∶1时研究其他因素对鱼油提取的影响。

图1 加酶量对鱼油提取率的影响(n=3)不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Fig.1The effect of concentration of enzyme onthe yield of fish oil(n=3)Different lowercases indicates significant difference (P<0.05).The same below.

图2 液固比对鱼油提取率的影响(n=3)Fig.2The effect of liquid-solid ratio on the yieldof fish oil(n=3)

2.3.3 酶解时间对鱼油提取率的影响

在液固比为1∶1、加酶量为6×103U/g(以原料计)、酶解温度为60 ℃、酶解pH为6.0的条件下，按照酶解时间分别为1、2、3、4和5 h进行酶解时间的优化。结果如图3所示，当酶解时间小于3 h时，鱼油提取率随着酶解时间的增加而升高。酶解3 h时，可获得最高的提油率，酶与底物之间的作用较为充分，破坏了蛋白质和脂肪之间的结合，释放出了较多的油脂分子。当酶解时间大于3 h时，鱼油提取率升高的速度减慢，甚至有所下降。随着时间的延长，由于酶的热稳定性有所下降，蛋白与脂质的作用增强，水解作用降低，导致破乳效果较差，不利于鱼油的提取。因此综合鱼油提取率和设备利用率等因素，选择酶解时间为3 h。

图3 酶解时间对鱼油提取率的影响(n=3)Fig.3 The effect of hydrolysis time on the yieldof fish oil(n=3)

2.3.4 pH对鱼油提取率的影响

在液固比为1∶1、加酶量为6×103U/g(以原料计)、酶解时间为3 h、酶解温度为60 ℃的条件下，考察pH于5.0～9.0时，对鱼油提取率的影响，结果如图4所示。结果显示，当pH为5.0时，鱼油的提取率最低，pH过低不利于酶活性的发挥，限制了鱼皮中鱼油的释放。当pH为6.0时，酶活性相对较高，水解作用强，鱼油提取率最高。随着pH的升高，鱼油提取率有所下降，但仍保持在70%以上。综上，选择酶解最适pH为6.0。

图4 pH对鱼油提取率的影响(n=3)Fig.4The effect of pH on the yield of fish oil(n=3)

2.3.5 酶解温度对鱼油提取率的影响

在液固比为1∶1、加酶量为6×103U/g(以原料计)、酶解pH为6.0条件下，分别于50、55、60、65和70 ℃温度下酶解鱼皮3 h。从图5可得，温度对鱼油提取率的影响较大，当反应温度小于60 ℃时，鱼油的提取率随着温度的上升而升高；当温度为60 ℃时，鱼油的提取率最高，随着温度的进一步升高，鱼油提取率呈现降低的趋势。结果表明：温度会对酶促反应产生复杂的影响。温度过低，酶活力受到抑制；在一定温度范围内，温度的升高加快体系分子的热运动，从而提高了鱼油提取率；高温会使酶变性失活，影响酶的作用效果。因此，60 ℃为理想酶解温度。

图5 酶解温度对鱼油提取率的影响(n=3)Fig.5The effect of hydrolysis temperature onthe yield of fish oil(n=3)

试验号TestnumberA/ (U·g-1)BC/hD/℃提油率/%Oil extractability11(4 000)1(5)1(2)1(55)5.85212(6)2(3)2(60)43.09313(7)3(4)3(65)74.2042(6 000)13257.985221362.236232151.8673(8 000)12372.078323164.109331261.44K1123.141135.9129.519121.809K2172.071169.419167.019162.51K3197.61187.5196.281208.5K—141.04745.30043.17340.603K—257.35756.47355.67354.170K—365.87062.50065.42769.500R24.82317.20022.25428.897主次顺序D>A>C>B最优组合A3B3C3D3

2.4 正交试验结果与分析

根据单因素实验结果，对A(加酶量)、B(pH)、C(时间)和D(温度)4个因素进行正交实验优化。结果如表2，根据极差R值分析可知，酶解时的加酶量、pH、时间、温度对提油率的影响的主次效应为：D>A>C>B。即在该试验条件下，酶解温度对提油率影响最大，其次是加酶量，再次是时间，而pH的影响最小。4种酶解因素的优化组合为A3B3C3D3，即当加酶量为8×103U/g(以原料计)，pH为7.0，时间为4 h，温度为65 ℃时提油率最高。在最优条件A3B3C3D3下进行验证，木瓜蛋白酶的提油率可达88.03%。张佳婵等[25]通过正交实验对碱性蛋白酶酶解大鲵(Andriasdavidianus)尾部组织的提油工艺进行了优化，结果显示在温度为50 ℃、加酶量为1.5%、pH为6.0的条件下提油率最高，为63.9%。相比之下，本研究中木瓜蛋白酶对于鱼油的提取率保持着较高的水平。

2.5 三文鱼鱼皮油的理化指标

采用木瓜蛋白酶所提三文鱼鱼皮油呈淡黄色，清澈透亮，具有鱼油固有的气味。通过粗鱼油相关化学指标的测定，并对照不同级别粗鱼油的指标，可知本研究所提取三文鱼皮中的鱼油达到了SC/T 3502—2016规定的粗鱼油的二级标准(表3)，可用于进一步开发利用鱼油制品。

表3 粗鱼油的理化指标Tab.3 Physicochemical indexes of crude fish oil

3 结论

本研究以三文鱼鱼皮为原料，在加入相同酶活力单位的酶量前提下，从5种不同的蛋白酶中筛选出酶解效果最佳的木瓜蛋白酶，通过单因素实验和正交试验，得出4种酶解因素的优化组合是：加酶量为8×103U/g(以原料计)，pH为7.0，温度为65 ℃，时间为4 h。在此条件下提油效果最佳，提取率可达88.03%。制取的粗鱼油中水分及挥发物含量为0.5%，过氧化值为7.85 meq/kg，酸价为12.49 mg/g，碘价为162.55 g/100 g，杂质含量为0.5%，达到SC/T 3502—2016规定的二级粗鱼油标准，表明三文鱼皮等废弃物在鱼油的生产和加工中具有较高的利用价值。本研究所用原料为三文鱼加工后废弃鱼皮，采用酶解的方法提取鱼油，实验表明，该种提取方式反应条件温和，产品质量好、纯度高，为三文鱼皮的高值化利用及其他水产加工下脚料等废弃物的综合利用提供参考。