新型杀菌剂丁吡吗啉对烟草黑胫病生物学特性的影响

徐传涛,彭 勇,谢 强,屈 旭,冯 超

(1.四川省烟草公司泸州市公司，四川泸州646000；2.青岛中烟种子有限责任公司，山东青岛266100；3.中国农业科学院烟草研究所烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室，山东青岛266101)

烟草黑胫病是烟叶生产最具毁灭性的病害之一。烟草黑胫病是由烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起的土传病害。我国烟草黑胫病初见于1919年,由泽田兼吉撰写的“台湾产菌类调查报告”中(朱贤朝等,2002),20世纪40年代,病区扩展到黄河、长江以及珠江流域的各烟草产区,对当地烟叶生产造成严重损失。20世纪70年代后期到80年代末期,由于大量种植感病品种、烟田连作导致此病严重流行(陈瑞泰等,1997)。

丁吡吗啉[E-3-(2-氯吡啶-4)-基]-丙烯酰吗啉是由中国农业大学与中国农业科学院植物保护研究所共同开发的新型杀菌剂,其对致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)等重要植物病原菌均具有很好的抑制作用(陈小霞等,2007),但丁吡吗啉对烟草黑胫病生物学特性的影响未见报道。本文通过测定丁吡吗啉对烟草黑胫病菌毒力及其对烟草黑胫病菌产孢力、菌丝生长及继代培养菌敏感性的影响,探究丁吡吗啉对烟草黑胫病生物学特性的影响,以期为丁吡吗啉防治烟草黑胫病的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试药剂：丁吡吗啉(Pyrimorph,有效成分96%)原药,中国农业大学理学院提供。

供试菌株：烟草黑胫病菌(0号小种)(Phytophtora parasitica var.nicotianae)中国农业科学院烟草研究所提供。

供试培养基：燕麦培养基,将30 g燕麦于蒸馏水中煮沸,过滤,滤液中加入18 g琼脂,蒸馏水定容至1 000 mL,120℃灭菌20 min,冷却备用。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草黑胫病菌对丁吡吗啉的敏感性 用菌丝生长速率法(方中达,1998)测定烟草黑胫病菌对丁吡吗啉的敏感性。在预试验基础上,选择对菌丝生长抑制率在10%-90%的药剂浓度。先将试验药剂用DMSO溶液配制成10 000 mg·L-1母液,后用DMSO梯度稀释至1 000、500、100、50、10 mg·L-1。按体积比为1∶100的比例分别加入到融化后的培养基中,并充分混合均匀,倒入Ø ＝9 cm培养皿内制成含有系列浓度药剂的含药平板,以加入等体积DMSO的燕麦培养基平板为对照。采用Ø ＝5 mm的打孔器打取菌落边缘生长状况一致的菌饼,菌丝面向下接种于已经冷却的含药燕麦培养基中央,置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d。在自动菌落分析仪下采用十字交叉的方法测定供试菌株在不同浓度药剂条件下的菌落直径,与对照菌落比较计算各浓度药剂对菌落大小的抑制率,比较不同浓度药剂对供试菌株菌丝生长的影响,每个处理3个重复。所得数据经DPS统计软件求出毒力回归方程及EC50值。

1.2.2 丁吡吗啉对烟草黑胫病菌产孢力的影响 用1.2.1中的方法,配制浓度为0、0.5、1、2、5、10、20 mg·L-1的加药平板,同样将接种的平板黑暗培养5 d后,用Ø＝5 mm的打孔器分别打取各浓度菌落边缘的菌饼6片,置于无菌的Ø＝9 cm培养皿内,皿内加入5 mL的无菌水润湿菌丝。在恒温培养箱中26℃培养3 d诱导产生孢子,然后取100 μL溶液,采用血球计数法在显微镜下随机选取5个计数室,统计孢子数量,以无丁吡吗啉作对照,计算丁吡吗啉对烟草黑胫病菌的产孢抑制率(Matheron et al.,2000)。

产孢抑制率(%)＝(对照孢子数量-处理孢子数量)/对照孢子数量×100

1.2.3 丁吡吗啉对烟草黑胫病菌丝生长量的影响 在100 mL的锥形瓶内加入50 mL液体燕麦培养基灭菌备用,从活化好的燕麦培养基上的烟草黑胫病菌落边缘打取Ø ＝5 mm菌饼,分别接入备用的燕麦液体培养基内,每瓶3片菌饼。摇床内培养14 d后,在瓶内分别加入供试药剂使丁吡吗啉最终浓度为2、5、10、20 mg·L-1；继续培养7 d后将培养液抽滤去除,每个菌丝团用无菌水冲洗3-4次,于60℃烘箱内烘烤24 h后,称量含有菌丝的滤纸干重。求出菌丝干重,并计算抑制率。每个处理重复3次(秦维彩,2010)。

菌丝生长量抑制率(%)＝(对照菌丝干重-处理菌丝干重)/对照菌丝干重×100

1.2.4 继代培养的烟草黑胫病菌对丁吡吗啉敏感性的影响 菌株在含有丁吡吗啉的浓度为2和5 mg·L-1的培养基上连续培养至第5代,然后取F0,F3,F5代的培养物分别置于含有系列浓度丁吡吗啉的含毒培养基上,26℃培养5 d后测量菌落直径,以F0代不加药剂做为对照,每处理重复4次,计算EC50值并进行比较(袁宗胜等,2001)。

2 结果与分析

2.1 丁吡吗啉对烟草黑胫病菌的毒力

丁吡吗啉对烟草黑胫病菌菌丝生长速率的抑制回归方程为Y＝1.9213X+4.3457(相关系数r＝0.99),室内抑菌试验结果表明,丁吡吗啉对烟草黑胫病菌的EC50值为2.19 mg·L-1,95%置信限为1.68-2.93 mg·L-1。

2.2 丁吡吗啉对烟草黑胫病菌产孢的影响

由表1可以看出,当丁吡吗啉浓度为0.5和1 mg·L-1时,对烟草黑胫病的孢子囊形成抑制率分别为39.5%和60.5%,处于较低的水平。但当丁吡吗啉浓度达到2 mg·L-1时,其对烟草黑胫病菌的产孢抑制率可达81.4%,浓度变大后孢子囊形成抑制率也变大。丁吡吗啉对烟草黑胫病孢子形成的EC50为0.66 mg·L-1,毒力线性回归方程是：Y＝1.4529X+5.2609(r＝0.988)。相较于丁吡吗啉对烟草黑胫的菌丝抑制效果要显著。

表1 丁吡吗啉对烟草黑胫病孢子形成的影响Table 1 Effect of pyrimorph on the sporulation of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.3 丁吡吗啉对烟草黑胫病菌丝生长量的影响

由表2可以看出,丁吡吗啉的浓度与对烟草黑胫病菌菌丝生长量的抑制率成正相关性,随着丁吡吗啉药剂浓度的变大其对烟草黑胫病菌菌丝生长量的抑制越大。试验中最高丁吡吗啉浓度为20 mg·L-1时,对生长量的抑制率为(77.6±4.3)%,最药剂浓度2 mg·L-1时,对菌丝生长量的抑制率为(17.4±3.1)%。毒力回归方程为Y＝1.7886X+3.4307,相关系数 r＝0.9809,EC50为 7.53 mg·L-1。

表2 丁吡吗啉对烟草黑胫病菌菌丝生长量的影响Table 2 Effect of pyrimorph on the mycelial growth of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.4 继代培养的烟草黑胫病菌对丁吡吗啉敏感性的影响

由表3可知,烟草黑胫病菌经继代培养后对丁吡吗啉的耐药性均有不同程度的增加,并随着培养代数的增加其耐药性也在增加。在5 mg·L-1条件下培养的黑胫病菌株,F0代对丁吡吗啉的 EC50为2.19 mg·L-1,而经过三代培养后 F3代对丁吡吗啉的 EC50增长为 2.38 mg·L-1,五代培养后F5丁吡吗啉的EC50增长为3.33 mg·L-1。2 mg·L-1条件下五代培养后F5丁吡吗啉的EC50增长为4.41 mg·L-1,明显高于5 mg·L-1条件下的EC50,可能原因为两株菌株对丁吡吗啉的敏感性产生了明显的分化。由此可知黑胫病菌株在烟草黑胫病的继代培养过程中,菌株对丁吡吗啉的敏感性在逐渐降低,即烟草黑胫病对丁吡吗啉抗性风险的增加是随着丁吡吗啉施用代数的增加缓慢增加。

表3 烟草黑胫病菌继代培养菌对丁吡吗啉的敏感性Table 3 Sensitivity of the subculture of Phytophthora parasitica var.nicotianae to pyrimorph

3 结论与讨论

烟草黑胫病防治措施主要有：种植抗病品种,加强田间管理,化学药剂防治,生物药剂防治等(Lucas,1975；Shew,1984)。其中抗病品种多因“抗性基因变异或丧失”而失去抗病性,而化学防治是防治烟草黑胫病最经济有效的手段,特别是在病害大流行的时期(汪汉成等,2011)。常见的用于防治烟草黑胫病的化学药剂有：甲霜灵,烯酰吗啉,霜霉威,三乙磷酸铝,代森锰锌,甲霜灵·锰锌等。但由于甲霜灵、甲霜灵·锰锌等药剂的长期使用已经产生严重的抗药性(袁宗胜等,2001),为此亟待解决防治烟草黑胫病药剂的替代问题。

试验结果表明,丁吡吗啉对烟草黑胫病菌菌丝生速率、孢子萌发、菌丝生长量均具有良好的抑制效果。结合目前的生产实际在烟草黑胫病的防治过程中可以通过以下三种方式提高防治效果：(1)抗病品种与化学药剂相结合,可以减少使用化学药剂的次数和降低病原菌抗药性的产生；(2)丁吡吗啉与其他常见杀菌剂交替使用,合理用药；(3)将丁吡吗啉与非内吸性保护剂及其他的杀菌剂混配使用。