圆齿野鸦椿叶片总黄酮提取工艺的研究

向 双,陈泽明,张晓华,邹双全

(福建农林大学林学院，自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建福州350002)

圆齿野鸦椿(Euscaphis konishii Hayata),属省沽油科(Staphyleaceae)野鸦椿属(Euscaphis),是我国特有的常绿小乔木。广泛分布在福建、江西、浙江等地。其树形优美,果实通红亮丽,是一种优良的观赏树种,在园林上可群植、片植,亦可作为观赏树和行道树等。同时,圆齿野鸦椿是一种民间传统药用植物(敖小朋等,2009),可抗炎阵痛(董玫等,2004)、抗肿瘤(左敏等,2008)、杀虫杀菌等,其根、花、果实可入药。

黄酮类化合物是广泛存在于药用植物中的一类化合物,邹小兴等人(2016)采用系统预试法对圆齿野鸦椿叶及枝条化学成分进行预试验,结果表明,圆齿野鸦椿叶及枝条可能含有黄酮类、生物碱、皂苷、醌类等化学成分。黄酮类化合物可以抑制或诱发一些与重要酶促反应有关的酶的生成,如免疫响应、解毒、消炎、调节细胞分裂和繁殖等(陈建琴等,2010)。黄酮的提取方法有很多,曹洪斌等(2017)在杜仲总黄酮提取里用了水提法、溶剂提取法、超声提取法、微波提取法、酶提取法以及半仿生法。传统提取法存在提取率低,杂质多等问题,而超声波提取法比起传统的热回流提取方法更为简便快捷,黄酮提取率更高(崔莹,2017)。本次试验采用超声波法提取圆齿野鸦椿叶片中总黄酮,通过正交试验对料液比、乙醇浓度、超声波功率、提取时间四个因素进行考察研究,确定出圆齿野鸦椿叶片总黄酮超声波提取的最优工艺条件,并测出总黄酮提取率,以期为圆齿野鸦椿总黄酮研究提供参考,有利于更深入地挖掘圆齿野鸦椿的药用价值,为今后对圆齿野鸦椿的生理保健作用的开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

圆齿野鸦椿样品采于福建省邵武市将石自然保护区,取一年生枝的枝顶叶片。

1.2 试验方法

1.2.1 建立芦丁标准曲线 标准溶液配置：将芦丁对照品置于烘箱105℃干燥至恒重,精密称取10 mg于100 mL小烧杯中,用70%乙醇温热溶解,冷却至常温,然后转移到100 mL容量瓶中,并用70%乙醇定容,摇匀。

绘制标准曲线：准确吸取0(不加芦丁标准液,作为参比)、1、2、3、4、5 mL的芦丁标准溶液放置于25 mL的容量瓶中,加入5%NaNO2溶液1 mL,摇匀,放置6 min；加入10%的Al3(NO3)溶液1 mL,摇匀后放置6 min；加入5%的NaOH溶液10 mL,用乙醇定容至刻度,摇匀,放置15 min。按照分光光度法在510 nm波长处测定其吸光度,以加入芦丁标准液的浓度为纵坐标,相应的吸光值为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.2 单因素试验 称取5份经60℃干燥后粉碎过40目筛的圆齿野鸦椿叶片粉末,各1 g,在料液比分别为1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40,、1 ∶50,乙醇浓度分别为 50%、60%、70%、80%、90%,超声波功率分别为 150、175、200、225、250 W,提取时间分别为 15、20、25、30、35 min 的条件下进行单因素试验,测定吸光值,计算黄酮提取率。每次试验重复3次,以料液比、乙醇浓度、超声波功率、提取时间对超声波提取圆齿野鸦椿叶片总黄酮的影响进行研究。

1.2.3 正交试验 根据单因素试验的结果,以料液比、超声波功率、乙醇浓度和超声时间为四个考查因素,分别选取3个水平按L9(34)进行正交试验设计(表1)。

表1 超声波提取法正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test by ultrasonic extraction

1.2.4 总黄酮提取率的计算 圆齿野鸦椿叶片黄酮提取率的计算公式为

式中：A为吸光值；d为提取液稀释倍数；V为提取液体积；m为圆齿野鸦椿叶片质量。

1.3 数据分析

采用SPSS statistics 19软件,对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以不加芦丁标准液为参比,按照分光光度法在510 nm波长条件下测定其吸光度,得到直线回归方程为Y＝0.1050A-0.0004(R2＝0.9995),表明芦丁浓度在0.01-0.04 mg·L-1内呈现良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线Figure 1 Rutin standard curve

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对提取率的影响研究 从图2可以看出,圆齿野鸦椿叶片黄酮的提取率随料液比的增大而呈现出先升高后逐渐下降的趋势,且提取率在料液比1∶30时达到最大。因此将正交试验中料液比的三个水平设定为1∶20,1∶30,1∶40。

2.2.2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响 从图3中可以看出,圆齿野鸦椿叶片黄酮的提取率随着乙醇浓度的升高而表现出先升高后缓慢下降的趋势,且提取率在乙醇浓度为70%时达到最大值。因此将正交试验中的乙醇浓度设定为60%,70%,80%。

图2 料液比对总黄酮提取率的影响Figure 2 Effect of the ratio of solid extract to liquid extract on the extraction rate of total flavonoids

图4 超声波功率对总黄酮提取率的影响Figure 4 Influence of ultrasonication power on the extraction rate of total flavonoids

图3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Figure 3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

图5 提取时间对总黄酮提取率的影响Figure 5 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 超声波功率对黄酮提取率的影响 从图4中可以看出,随超声波功率的增大,圆齿野鸦椿叶片黄酮的提取率先升高后降低,在超声波功率为200 W时达到最大值。因此将正交试验中超声波功率的影响因素水平设置为175、200、225 W。

2.2.4 超声波时间对黄酮提取率的影响 从图5中可以看出,随提取时间的增加,圆齿野鸦椿叶片总黄酮的提取率先不断升高,在提取时间为30 min时达到最大,随后开始下降。因此将正交试验设计中的超声时间水平定为25、30、35 min。

2.3 正交试验结果

在上述料液比、乙醇浓度、超声波功率、超声波时间四个单因素试验的基础上,得到超声波提取圆齿野鸦椿总黄酮正交试验所需要的因素。从表2可以看出,影响总黄酮提取率的因素大小顺序是提取时间＞料液比＞乙醇浓度＞超声波功率,确定A1B3C2D3是圆齿野鸦椿叶片总黄酮提取的最佳方案,即料液比为1∶20,乙醇浓度为80%,超声波功率为200 W,超声波时间为35 min。

对试验结果进行方差分析,结果如表3所示,四个因素对圆齿野鸦椿黄酮提取率影响均达到极显著。说明该试验结果合理,设计可靠。

表2 超声波提取法正交试验结果Table 2 Result of orthogonal test for ultrasonic extraction

表3 正交试验结果方差分析Table 1 Results of orthogonal test subjected to analysis of variance

2.4 重复性试验

按照优选的组合A1B3C2D3进行5次重复性试验,结果表明,黄酮的平均提取率为3.77%,比正交试验中的任何一组都好,其相对标准偏差(RSD)为1.76%,表明该工艺稳定。

3 小结与讨论

由于超声波辅助提取法相较于传统方法,具有方便快捷,提取率高的特点(禚同友,2015),因此在黄酮提取上广泛运用。董兰岚等(2017)用超声法提取黄桷树叶的总黄酮,段志芳等(2007)对溪黄草进行超声提取总黄酮,方兰等(2017)对金线草总黄酮进行超声提取,但目前尚未见到有关圆齿野鸦椿黄酮提取工艺的研究。本试验得出超声波提取圆齿野鸦椿叶片总黄酮的最优条件是,料液比1∶20,乙醇浓度80%,超声波功率200 W,超声波时间35 min,四个因素中对于圆齿野鸦椿叶片总黄酮提取影响最大的是超声时间。从大量有关黄酮提取的研究结果(李志霞等,2010；罗磊等,2017)来看,不同物质的最佳提取工艺会有不同,提取率高低也不一样。其中,料液比1∶20是常见的最佳条件,乙醇浓度70%为黄酮提取的最佳浓度,可以为相关试验提供参考。但在具体试验中,可能因试验材料的不同产生误差,所以还应根据实际情况确定相应的试验条件。本次试验对圆齿野鸦椿黄酮的提取方法进行了研究,希望可以为后续对黄酮类化合物的分离纯化以及生理活性等研究提供参考,以期为圆齿野鸦椿的深入研究和利用奠定基础。