去酰基化ghrelin抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖

窦磊，庞晓燕，李奇，尚海，张颐

（1. 中国医科大学附属第一医院妇科，沈阳 110001；2. 辽宁省肿瘤医院肝胆胰外科，沈阳 110042）

卵巢癌是女性常见恶性肿瘤，其发病率高，死亡率占各类妇科肿瘤首位。由于就诊时卵巢癌患者多为晚期，卵巢癌5年生存率仅约30%。尽管近年化疗取得重要进展，但卵巢癌5年生存率无明显提高［1］。目前认为上皮性卵巢癌的组织学起源具有多样性，遗传因素和环境因素等导致的基因突变，机体内分泌激素、生长因子等的异常分泌，均可导致上皮性卵巢癌［2］。因此，研究导致上皮性卵巢癌发生的致病因素和分子机制，可为卵巢癌的早期诊断和有效治疗提供理论依据。

多种细胞因子参与了卵巢癌的发生和发展。本课题组的前期研究［3］表明，酰基化的胃肠激素ghrelin可抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖。ghrelin主要由胃黏膜X/A样细胞分泌，由28个氨基酸组成，在人体其他组织如下丘脑、垂体、海马、大脑皮质、小肠、胰腺及胎盘中，也都有少量的合成［4］。ghrelin存在独特的翻译后修饰，即第3位丝氨酸残基在ghrelin酰基化酶的作用下发生酰基化 （主要为辛酰化）［4-5］，形成酰基化ghrelin （acyl ghrelin，AG） ，这种酰基化对ghrelin结合并激活其受体——生长激素促泌素受体1a （growth hormone secretagogue receptor 1a，GHSR1a）十分关键［4］。AG可以通过作用于这种G蛋白耦联受体，发挥刺激垂体生长激素释放、刺激摄食、调节能量代谢等作用。因此长期以来，人们认为AG是gh-relin的活性形式，而在血液中占较大比例 （90%） 的去酰基化ghrelin （des-acyl ghrelin，DAG） 并无生物学活性。然而越来越多的临床证据表明，虽然不能激活GHSR1a，DAG仍然具有生物学功能。本研究通过观察DAG对卵巢癌细胞增殖的影响，旨在为分子生物靶向治疗卵巢癌提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂

DAG （美国Phoenix Pharmaceuticals公司） ，亮氨酸 （美国Santa Cruz公司） ，Wnt通路激动剂SKL2001（美国Sigma公司） ，CCK-8细胞增殖检测试剂盒 （日本同仁化学公司） ；Trizol、RNA提取及逆转录试剂盒、萤光素酶报告基因检测试剂盒 （美国Promega公司） ，Taq酶 （北京天根公司） ，Evergreen荧光染料 （美国Biotium公司） ，兔抗总核糖体蛋白S6和磷酸化S6（美国Cell Signaling Technology公司） ，Wnt信号通路活性检测FOPF质粒 （美国Millipore公司） ，jetPEI转染试剂 （美国Polyplus-transfection公司） 。其他试剂均购于美国Sigma公司。

1.2 细胞培养及CCK-8检测细胞增殖

上皮性卵巢癌SKOV3细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，达到对数生长期后接种于96孔板 （1×104/孔） 。12 h待贴壁后更换含不同浓度（10-10， 10-9， 10-8， 10-7mol/L） DAG的RPMI 1640培养液，以不含DAG的相同胎牛血清浓度的RPMI 1640完全培养液作为对照，或者加入亮氨酸、SKL2001处理48 h后收样，每孔加入10 μ L CCK-8试剂，孵箱内37℃放置1～4 h后，使用酶标仪测定450 nm波长的光吸收值［6-8］。

1.3 RNA提取

SKOV3细胞接种于6孔板，依上述处理后，弃去培养液，PBS洗涤，加入1 mL Trizol试剂晃动并吹打，待细胞全部裂解后移入EP管，室温放置10 min；加入氯仿0.2 mL，剧烈颠倒混匀抽提15 s，室温放置5 min，4 ℃下12 000 g离心15 min；上层水相转移到新EP管中，加入等体积异丙醇充分混匀，置于-70 ℃沉淀2 h，4 ℃下12 000 g离心10 min；弃上清，用预冷的1 mL 75%乙醇洗涤沉淀后，4 ℃下12 000 g离心10 min；弃上清后瞬时离心，吸去残液。晾干5～10 min后加20～50 μ L去RNA酶纯水溶解并定量［6-8］。

1.4 实时定量PCR

使用Promega公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，RNA逆转录反应为20 μ L反应体系，2 μ g RNA起始量，依照试剂盒说明书进行［6-8］。实时定量PCR为25 μ L反应体系，以逆转录反应混合物1 μ L为模板。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环后72 ℃延伸5 min［6-8］。采用Stratagene Mx3000软件进行分析。引物序列：人增殖细胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 上 游5’-TGTTGGAGGCACTCAAGGA C-3’，下 游5’-TCATTGCCGGCGCATTTTAG-3’；人c-myc上游5’-TGCTCCATGAGGAGACACC-3’，下游5’-CTTTTCCACAGAAACAACATCG-3’；人cyclinD1上游5’-GAAGATCGTCGCCACCTG-3’，下游5’-GAC CTCCTCCTCGCACTTCT-3’；人β-actin上游5’-ATC TGGCACCACACCTTC-3’，下 游5’-AGCCAGGTCCA GACGCA-3’［6-8］。

1.5 荧光素酶活性测定

SKOV3细胞种植于12孔板中，以jetPEI试剂转染0.5 μ g质粒6 h后，给予DAG处理，孵育24 h后弃去培养液，PBS洗涤后匀浆，采用Promega公司的Dual-LuciferaseTMReporter Assay System 检测荧光素酶活性［7，9］。

1.6 统计学分析

采用Prism软件进行分析和作图。数据以x-±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用Student-Newman-Keuls法。2组间比较采用组间t检验。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAG呈剂量依赖性抑制SKOV3细胞增殖

本研究首先探讨了DAG对SKOV3细胞增殖的直接作用。CCK-8检测结果显示，10-10～10-7mol/L的DAG作用SKOV3细胞48 h可以显著抑制细胞增殖（P ＜ 0.05，图1B） ，且随着胎牛血清浓度的增加，这种抑制作用仍然存在 （图1A） 。实时定量PCR结果亦显示，DAG组PCNA mRNA表达水平仅为对照组的50.4%，提示DAG组PCNA的表达显著被抑制。

2.2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR） 信号途径参与DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用

图1 CCK-8检测DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用Fig.1 DAG inhibition of SKOV3 cell proliferation as detected by the CCK-8 assay

本研究进一步探讨了DAG抑制SKOV3细胞增殖的可能机制。结果发现，10-7nmol/L的DAG可显著抑制SKOV3细胞中mTOR下游靶分子核糖体蛋白S6的磷酸化激活水平 （图2） ，而以支链氨基酸亮氨酸激活mTOR信号途径后，可以翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用 （图3） 。

图2 Western blotting检测mTOR下游靶分子S6的磷酸化水平Fig.2 Phosphorylation level of the target molecule S6 downstream of mTOR as detected by Western blotting

图3 CCK-8检测mTOR激动剂亮氨酸翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition of SKOV3 cell proliferation by the mTOR agonist，leucine-flipped DAG，as detected by the CCK-8 assay

2.3 DAG抑制SKOV3细胞经典Wnt信号通路

FOPF质粒是一种测定细胞内β-catenin介导的转录活性的方法，本研究以TOPFlash为报告质粒、FOPFlash为阴性对照，以pRL-TK质粒为内参，SKOV3细胞jetPEI试剂转染6 h后，10-7mol/L的DAG处理24 h后进行双荧光素酶活性检测，结果显示DAG刺激下TOPFlash/FOPFlash比值明显低于对照组 （P ＜ 0.05，图4A） ，经典Wnt信号传导通路下游靶基因c-myc与cyclinD1 mRNA水平明显下调 （P ＜0.05，图4B） 。说明DAG可抑制经典Wnt信号通路，使下游转录活性明显降低。而以经典Wnt通路激动剂SKL2001处理后，可以翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用 （图5） 。

3 讨论

本研究首次证实了DAG可通过mTOR信号途径和经典Wnt信号途径抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。依据如下： （1） DAG处理卵巢癌SKOV3细胞可抑制其增殖 （图1） ； （2） DAG可抑制mTOR信号通路（图2） 和经典Wnt信号转录活性及下游靶基因mRNA水平 （图4） ； （3） 激活mTOR （图3） 和Wnt信号途径（图5） 可在一定程度上翻转由DAG抑制的卵巢癌SKOV3细胞增殖。

DAG与AG具有相同的氨基酸序列，只是其第3位氨基酸 （丝氨酸3） 没有辛酰化［10］。起初，尽管DAG占据循环中总ghrelin的90%以上，但其长期以来被认为是AG的一种降解产物，并且没有生物学活性［11］。因其在生理学浓度范围内不能结合激活GHSR1a，所以在研究领域并未受到应有的重视［4，12］。2004年，BROGLIO等［13］扭转了普遍观点，提出DAG也是一种激素。经实验证实，DAG可以拮抗AG某些生物学活性［14-15］，中枢或腹腔内注射时，可以抑制AG的促食欲作用［16］；或者作为一种与AG完全无关的多肽而存在［17-18］。DAG与AG也可能存在相同的作用。总体来说，就外周作用而言，DAG在调节葡萄糖或胰岛素代谢［19-21］、能量平衡［22］、胃肠蠕动［23］等方面存在与AG相反的作用，而在心血管方面的作用［12］则类似于AG。本研究发现，在卵巢癌细胞增殖方面，DAG与AG起到协同作用，均可抑制肿瘤细胞的增殖。

图4 DAG抑制经典Wnt信号通路Fig.4 DAG inhibits the classical Wnt signaling pathway

图5 Wnt信号通路激动剂SKL2001翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用Fig.5 Inhibition of SKOV3 cell proliferation by the Wnt signaling pathway activator，SKL2001，and DAG turnover

mTOR可感受细胞内外能量水平，通过调节蛋白转录和翻译从而调节细胞和组织的存活、生长、增殖和分化［24］。mTOR的抑制剂雷帕霉素则可以抑制mTOR下游S6核糖体蛋白，抑制PCNA基因的转录，调节细胞周期和分化。本研究阐明了DAG可以抑制mTOR及其下游靶分子S6的磷酸化激活，进而抑制PCNA基因的转录，从而抑制卵巢癌细胞的增殖。

Wnt信号通路最初由小鼠乳腺癌中发现，经典途径激活过程中，胞质β-catenin降解受抑制，异常蓄积，之后β-catenin进入细胞核，与T细胞因子或淋巴增强因子形成转录因子复合体，调控cyclinD1和c-myc等下游靶基因的转录表达［25-26］，在肿瘤细胞的增殖和去分化过程中起着非常重要的作用。研究［27］表明，β-catenin在正常卵巢、良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤及卵巢癌组织中的异常表达依次呈上升趋势，这种异常分布与肿瘤的浸润程度和淋巴结转移均相关；Wnt信号通路还可参与肝癌细胞的增殖［7］。本研究表明，DAG可抑制β-catenin介导的转录活性；并且Wnt的下游靶基因cyclinD1和c-myc转录表达水平亦明显下降。本研究结果表明，DAG可能通过抑制Wnt信号通路，抑制了卵巢癌SKOV3细胞的增殖。

综上所述，本研究发现，DAG可通过抑制mTOR信号通路和经典Wnt信号通路抑制卵巢癌细胞的增殖，从而为卵巢癌的治疗提出新的思路。