脂肪源性干细胞：甲状旁腺样细胞自体移植的新来源

张平，张浩，董文武，王志宏，秦元，董齐，2

（中国医科大学 1. 附属第一医院甲状腺外科，沈阳 110001；2. 人民医院普通外科，沈阳 110016）

随着甲状腺手术方法的不断改进，其成功率和安全性越来越高，更多的甲状腺疾病患者能获得有效且满意的治疗［1］。但由于甲状腺和甲状旁腺解剖结构的紧密性，甲状腺手术势必会对甲状旁腺造成不同程度的损伤，从而导致术后甲状旁腺功能减退症 （简称甲旁减） ，这是影响甲状腺手术安全性和术后疗效的主要因素［2-3］。甲状腺手术后的甲旁减发生率可高达14%［4］，即使是经验丰富的甲状腺专科医生施行手术后甲旁减发生率也可达0.5%～4%［5-6］。

目前甲旁减的治疗多以药物替代为主，但却有服用繁琐、不良反应大、价格昂贵等缺点［7］。而甲状旁腺的异体移植因免疫排斥、医学伦理等诸多问题，临床应用受到限制。手术中甲状旁腺的自体异位移植可取得良好的效果，但外科医生在手术当中并不能及时发现甲状旁腺的损伤或误切。当术后出现甲旁减时，已无可移植的种子细胞。因此，本研究拟探索建立应用Sonic hedgehog （Shh） 和激活素A（Activin A） 将脂肪源性干细胞 （adipose-derived stem cells，ADSCs） 分化成甲状旁腺样细胞的方法，为治疗甲旁减开辟一条崭新的途径。

1 材料与方法

1.1 脂肪细胞的获取

选用清洁级、雄性、纯系、4周龄SD大鼠，体质量150～200 g。戊巴比妥钠 （40 mg/kg） 腹腔注射麻醉后，无菌切取双侧腹股沟区脂肪，以备ADSCs的分离用。

1.2 ADSCs的分离、纯化和鉴定

1.2.1 分离纯化：将切取的脂肪组织置入含有1 000 U/mL青链霉素的PBS中浸泡10 min后，用不含抗生素的PBS反复冲洗，仔细去除血管和其他组织。将其剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小块，置于10 mL 0.075%Ⅰ型胶原酶中，37 ℃摇床120 r/min消化30 min。用等体积含10%胎牛血清的高糖DMEM中和胶原酶，1 200 r/min离心10 min。将沉淀物重悬后用200目筛网过滤，再次离心获得细胞沉淀。使用红细胞裂解液处理3 min，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM终止处理，PBS洗涤后接种于6 cm培养皿中，接种密度为2×105/cm2。48 h后更换培养基，去除未贴壁细胞。以后隔日半量换液。细胞90%融合后，0.25%胰酶消化，1∶3传代接种。取第3代细胞进行干细胞鉴定。

1.2.2 诱导及鉴定：

1.2.2.1 细胞成脂诱导及鉴定 加入成脂诱导液 （含L-DMEM，10%胎牛血清，地塞米松1 μ mol/L，吲哚美辛200 μ mol/L，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L，胰岛素10 μ mol/L） 。隔日换液。诱导21 d后，油红O染色，倒置显微镜下观察细胞内脂滴形成。

1.2.2.2 细胞成骨诱导及鉴定 加入成骨诱导液 （含L-DMEM，10%胎牛血清，地塞米松0.1 μ mol/L，抗坏血酸50 μ mol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，维生素D3 0.01 μ mol/L） 。3 d换液1次。诱导21 d后，茜素红染色，倒置显微镜下观察钙沉积。

1.3 建立ADSCs分化为甲状旁腺样细胞的方法

取第5代ADSCs，在含5% 胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，实验组加入Shh （100 ng/mL） 和Activin A （75 ng/mL） ，对照组加入等量的溶剂DMSO，倒置显微镜下观察分化细胞的形态学变化，应用酶联免疫吸附实验测定培养液中甲状旁腺激素 （parathyroid hormone，PTH） 的含量。

2 结果

2.1 大鼠ADSCs成脂诱导鉴定结果

ADSCs加入成脂诱导液诱导21 d后，油红O染色，倒置显微镜下观察脂滴形成。结果显示，细胞内脂滴的数量逐渐增加，证明ADSCs细胞的成脂诱导成功。见图1。

图1 ADSCs成脂诱导后脂滴形成 ×400Fig.1 Lipid induced lipid droplets formation in ADSCs ×400

2.2 大鼠ADSCs成骨诱导鉴定结果

ADSCs加入成骨诱导液诱导21 d后，茜素红染色，倒置显微镜下观察钙沉积。结果显示，细胞内钙盐沉积的数量逐渐增加，证明ADSCs细胞的成骨诱导成功。见图2。

2.3 大鼠ADSCs向甲状旁腺样细胞分化诱导结果

将诱导成功的ADSCs在含Shh （100 ng/mL） 和Activin A （75 ng/mL） 的培养基中培养21 d后，酶联免疫吸附实验检测PTH含量。结果显示，实验组培养液中PTH含量［（97.27±11.26） pg/mL］大于对照组［（46.99±8.95） pg/mL］ ， 提 示Shh和Activin A对ADSCs分泌PTH有明显的促进作用 （P ＜ 0.05） ，见图3；显微镜下观察到大量甲状旁腺样细胞，见图 4。

3 讨论

图3 Shh和Activin A处理ADSCs 21 d后PTH含量的变化Fig.3 Changes of PTH content after treatment of ADSCs for 21 d at different concentrations of Shh and Activin A

甲状旁腺自体移植是减少甲旁减发生的重要措施。药物替代是目前治疗甲旁减的主要方式，包括人工合成的甲状旁腺素、钙剂、维生素D制剂等。这些药物的应用过程繁琐，患者需要反复抽血监测以调整用量，药物本身还有很多不良反应，导致患者的依从性较差［7］，严重影响药物替代的临床治疗效果。而甲状旁腺的异体移植，因免疫排斥、医学伦理等诸多问题，临床应用也受到限制［10］。实践证明，手术中甲状旁腺的自体异位移植可取得良好的效果，有效率达70%～95%。甲状旁腺适合细胞移植，究其原因有以下几个方面［11-12］：（1） 甲状旁腺无导管、滤泡及门脉循环，每个甲状旁腺细胞都能独立发挥和器官一样的功能，无需器官构建即可用于移植并发挥作用； （2） 移植少量的甲状旁腺细胞，即可完成整个器官的正常功能； （3） 患者手术后发生的甲旁减多为医源性的甲状旁腺损伤，不存在免疫方面的异常，不影响移植效果。但由于术中情况的复杂性，外科医生并不能及时发现甲状旁腺的损伤或误切，当术后出现甲旁减时，已无可移植的种子细胞。因此，找到充足、安全的甲状旁腺种子细胞并进行自体移植，成为临床治愈甲旁减的唯一可能。

图4 Shh和Activin A处理ADSCs 21d后细胞形态变化 ×200Fig.4 Morphological changes of cells after treatment of ADSCs for 21 d with Shh and Activin A ×200

干细胞与再生医学的发展为解决这一问题提供了契机。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。根据其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞；根据其分化的细胞系，可分为造血干细胞和间充质干细胞等［13］。成体干细胞具有一定的可塑性，即来自某一组织的干细胞还可分化成其他组织类型的细胞。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，存在于人体的多种组织中，如骨髓、脂肪、胸腺、胰腺等成体组织，在体外特定的诱导条件下，可分化为3个胚层的多种细胞和组织［14-15］。近来，国外已有学者在将干细胞分化为甲状旁腺样细胞的研究方面进行了大胆尝试。BINGHAM等［11］首次报告了在Activin A的作用下将胚胎间充质干细胞成功分化成甲状旁腺样细胞的经验。WOODS等［12，16］通过Activin A和Shh的诱导，分别从小儿的胸腺细胞和胚胎间充质干细胞中分化出甲状旁腺样细胞。GREEN等［17］应 用Activin A、NOGGIN和SB-431542，将胚胎间充质干细胞和诱导多功能干细胞分化成前肠管的内胚层，并提出在Shh或FGF8的作用下可能进一步分化出甲状旁腺样细胞。目前国内在该领域的研究尚属空白。2001年和2002年ZUK等首先描述了ADSCs的多向潜能。ADSCs属于成体间充质干细胞的一种，具有相似的分化特性。它具有来源丰富、取材简便安全、所含的干细胞数量多、具有一定的抗感染能力等诸多优点［8-9］，临床应用前景十分广阔。目前其分离、培养、纯化、鉴定技术均已成熟［9，18-19］。它具有多向分化潜能，可成功分化为3个胚层的多种细胞和组织［20-21］，部分已应用于临床。大量研究表明，Activin A和Shh在干细胞分化成甲状旁腺样细胞的过程中起着至关重要的作用。

本研究从大鼠脂肪细胞分离出ADSCs，应用100 ng/mL Shh+75 ng/mL Activin A诱导21 d，培养基中PTH明显增加，证明ADSCs成功分化成甲状旁腺样细胞，为脂肪源性干细胞分化成甲状旁腺样细胞提供了理论和实践的基础，为下一步进行甲状旁腺样细胞的自体移植提供了新的来源，同时也为治愈甲旁减开辟了一条崭新的途径。