新标记物GATA3在乳腺癌替代分子分型中表达的敏感性分析

曾文钦，杨宇琼，卢善明，朱文标

嘉应学院医学院1解剖教研室，2病理教研室；3梅州市人民医院//中山大学附属梅州医院病理科，广东 梅州514031

GATA3结合蛋白（GATA3）在乳腺发育、乳腺腔上皮细胞分化还包括特定的泌尿上皮、表皮、一些皮肤附属器中起重要作用[1-3]。GATA3表达还涉及乳腺癌的生长、分化、进展和转移性[4-5]。GATA3表达于乳腺导管和小叶癌、泌尿上皮癌的诊断，最近报道它还表达于一些胰腺癌、间皮瘤、唾液腺瘤、滋养层肿瘤和内胚窦瘤[2-3]。虽具有多重特异性，越来越多的证据表明GATA3在诊断原发和转移性乳腺癌是一个很有应用前景的肿瘤标记物[6-10]。在新的肿瘤标记物GATA3辅助诊断乳腺癌之前，细胞质标记物特异性囊肿病液体蛋白15（GCDFP15）和细胞膜标记物人乳腺珠蛋白（MGB）是最常用于诊断乳腺癌的标记物，它们虽显示很好的特异性，却缺乏敏感性，尤其在高级别乳腺癌如基底样乳腺癌和三阴癌的诊断[11-12]。国内外最新研究显示GATA3在乳腺癌中的表达敏感性高于GCDFP15和MGB，尤其在转移性乳腺癌的鉴别诊断具有重要价值[9-10，13]；可这些研究主要涉及组织病理学分型、样本类型或激素状态而未涉及分子分型[8-10，13-14]。乳腺癌在分子水平上具有高度异质性，即使组织形态相同，其分子遗传学改变也可能不尽相同[15]，精确的掌握乳腺癌患者分子分型中GATA3的表达特征，是GATA3作为新的肿瘤标记物诊断乳腺癌的前提条件。St. Gallen共识中也强调了乳腺癌多基因分子检测技术的重要性，若由于标本递送问题或经济原因无法开展，可采用IHC检测ER、PR，使用IHC和FISH检测HER2过表达或扩增来替代多基因分子分型法[16]；乳腺癌替代分子分型分为4型：HR阳性、HER2阴性型；HR阳性、HER2阳性型；HR阴性、HER-2阳性型；三阴型。本研究评估比较GATA3与传统标记物GCDFP15和MGB在原发和配对淋巴结转移乳腺癌的替代分子分型中的敏感性，为病理诊断不同分子分型的乳腺癌提供依据。

1 材料与方法

1.1 分子分型与分组

收集2013年3月～2016年3月在梅州市人民医院病理科确诊的已做替代分子分型的原发和配对淋巴转移性乳腺癌患者64例，St.Gallen国际共识虽强调了乳腺癌分子分型使用多基因分子检测技术的重要性，若由于标本递送问题或经济原因无法开展，可采用替代分子分型法，运用免疫组织化学（IHC）方法来检测雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR），使用IHC或原位杂交检测人表皮生长因子受体-2（HER2）过表达或扩增，把乳腺癌替代分子分型分为4型：激素受体阳性、HER2阴性（A型）；激素受体阳性、HER2阳性（B型）；激素受体阴性、HER2阳性（C型）；三阴型（D型）。由于Ki-67可靠性较差，A型不再细分亚型，每型各16例。

1.2 制作组织芯片

每个供体蜡块分别选取3个最有代表性的肿瘤区域穿刺构建乳腺癌组织芯片，设计组织阵列点数为18，采用在镜下容易识别的正常癌旁组织标记方向，芯片上每个标本直径3.0 mm，相邻两样本之间的距离为3 mm。

1.3 免疫组化染色

免疫组化采用EnVision两步法。单克隆抗体GATA3-L，稀释浓度1:50，购于Biocare Medical。多克隆抗体mammaglobin，稀释浓度1:320，购于Zeta Corp。单克隆抗体GCDFP15，稀释浓度1:40，购于Covance。HRP标记的鼠兔通用型二抗购自Dako。实验步骤按说明书进行，高温高压抗原修复；DAB显色，苏木精衬染。

1.4 结果判定

利用H-score（0～300）评分判定结果，即染色程度（0～3+）×染色范围（0%～100%）所得。设定H-score评分得分界值≥50作为阳性结果评定3种抗体的敏感性。所有结果由本院高年资病理医师分别计算，取两者评分的均值，评分得分误差大于5%的，由两人达成一致后再计入结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件处理，采用卡方检验或Fisher确切概率法分析乳腺癌替代分子分型3种抗体的敏感性，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GATA3在乳腺癌替代分子分型的敏感性不同

GATA3、GCDFP15、MGB在A型原发性乳腺癌的敏感性分别为：81%、31%、13%，差异有统计学意义（χ2=16.609，P=0.000）；在A型配对淋巴结转移性乳腺癌的敏感性分别为：81%、44%、31%，差异有统计学意义（χ2=8.671，P=0.013）；在B型原发性乳腺癌的敏感性分别为：88%、13%、19%，差异有统计学意义（χ2=23.087，P=0.000）；在B型配对淋巴结转移性乳腺癌的敏感性分别为：81%、13%、31%，差异有统计学意义（χ2=16.609，P=0.000）；在C型原发性乳腺癌的敏感性分别为：63%、19%、38%，差异有统计学意义（χ2=6.284，P=0.049）；在C型配对淋巴结转移性乳腺癌的敏感性分别为：50%、19%、31%，差异无统计学意义（χ2=3.429，P=0.206）；在D型原发性乳腺癌的敏感性分别为：13%、25%、6%，差异无统计学意义（χ2=2.139，P=0.467）；在D型配对淋巴结转移性乳腺癌的敏感性分别为：13%、19%、19%，差异无统计学意义（χ2=0.436，P=1.000，表1）。

2.2 GATA3在乳腺癌替代分子分型的表达程度不同

GATA3在乳腺癌替代分子分型的表达程度不同。在A型和B型原发性乳腺癌的阳性样本中，GATA3染色显示弥漫的强阳性表达；但是在C型和

D型原发性乳腺癌的阳性样本中，GATA3染色显示低、中度表达.GCDFP15和MGB在乳腺癌替代分子分型的表达没有差异，GCDFP15染色显示低、中度表达；MGB染色显示中、高度表达。

表1 GATA3、GCDFP15、MGB在乳腺癌替代分子分型的敏感性比较

图1 GATA3、GCDFP15、MGB在乳腺癌替代分子分型的表达

2.3 GATA3、GCDFP15、MGB在原发和配对淋巴结转移乳腺癌中表达的一致性比较

GATA3在原发和配对转移性乳腺癌表达显示很好的一致性，Kappa值为0.826＞0.75，差异有统计学意义（P＜0.05）；而GCDFP15的Kappa值为0.492＜0.75，MGB的Kappa值为0.593＜0.75（表2）。

表2 GATA3、GCDFP15、MGB在原发和配对淋巴结转移乳腺癌中表达的一致性

3 讨论

GATA3在原发和转移性乳腺癌表达保持很好的一致性，虽然它的病理诊断价值有待进一步的研究，但它在诊断乳腺癌中已成为新兴实用的肿瘤标记物，特别是在转移性乳腺癌[3，6-7，9-10]。众所周知，GCDFP15和MGB是诊断乳腺癌的传统肿瘤标记物，它们有很好的特异性，但缺乏敏感性，尤其在高级别乳腺癌如基底样癌和三阴癌表现最差[11-12]。最近研究报道：新的肿瘤标记物GATA3在乳腺癌中的表达比传统肿瘤标记物GCDFP15和MGB更敏感，可是，这些研究局限于标本类型（组织或细胞标本）、组织病理学分型或激素受体状态[7-9，14]。Braxton等[8]发现GATA3在诊断转移性乳腺癌的细胞标本中比GCDFP15和MGB更敏感，GATA3染色程度与区域与ER阳性、PR阳性、HER2阳性正相关。Gregor等[7]的一项最新研究显示GATA3在诊断三阴癌中是一个很实用的抗体，它比GCDFP15和MGB联合检测都更敏感，他们提议GATA3-L、GCDFP15和MGB联合检测是诊断三阴癌的最佳免疫标记组合方案。Sangoi等[9]一项来自2015年的开创性研究表明：GATA3在乳腺癌mRNA水平的表达明显高于GCDFP15和MGB，GATA3在原发和转移性乳腺癌的阳性率明显高于GCDFP15和MGB，可是这项研究只限于外科和细胞标本类型、临床肿瘤分型和分级，而ER、PR、HER2状态未涉及。乳腺癌在分子水平上具有高度异质性，即使组织形态相同，其分子遗传学改变也可能不尽相同[15]，精确的掌握乳腺癌患者分子分型中GATA3的表达特征，是GATA3作为新的肿瘤标记物诊断乳腺癌的前提条件，因此本论文进行了GATA3在乳腺癌替代分子分型表达敏感性分析的这项研究，本研究发现：GATA3在乳腺癌替代分子分型中的敏感性有差异：GATA3在A型、B型和C型乳腺癌的敏感性优于GCDFP15和MGB，与先前研究报道的一致，但是GATA3在D型乳腺癌的敏感性并未优于GCDFP15和MGB。基于本研究结论GATA3在不同分子亚型乳腺癌的诊断价值不同，应重新评估GATA3在D型乳腺癌的诊断价值。

若由于标本递送问题或经济原因无法开展，可采用IHC检测ER、PR、HER2，HER2为IHC2+不确定病例，需再进一步应用FISH检测基因扩增。本论文研究通过上述方法筛选和定义的替代分子分型包括ER、PR阳性、HER2阴性；ER、PR阳性、HER2阳性；ER、PR阴性、HER2阳性；三阴型；由于通过IHC检测表示细胞增殖活性的Ki-67存在争议，故本研究对A型不再细分亚型。单独列出ER、PR阳性、HER2阳性，即B型，强调HER2阳性在HR阳性乳腺癌的作用。

GATA3在乳腺癌的敏感性介于2.6%～100%，尤其在ER阴性相关乳腺癌的阳性率波动范围很大，可能解释的原因与组织芯片的应用有关：组织芯片会低估GATA3的阳性率，与针芯活组织检查相比局限于标本大小，在不同的研究中每个标本点数的多少和点的大小有差异；有一篇研究报道使用组织芯片每个肿瘤一个点直径大小为0.6 mm的方法发现GATA3在ER阳性乳腺癌的敏感性为39%，在ER阴性乳腺癌的敏感性为2.6%[16-17]。本研究在每个供体选取3个最有代表性的肿瘤区域穿刺，点直径大小为3.0 mm，构建乳腺癌组织芯片。判读阳性结果的界值不同也影响GATA3的敏感性，据研究报道定义GATA3核染色结果阳性的范围从任何核染色[3]、或至少达到1%的核染色[18]、或达到10%的核染色[19]，过渡达到20%以上的核染色[20]；本研究参照Ankur等[9]H-score评分：根据染色程度和染色范围计算得出一个数值，设定H-score评分得分界值≥50作为阳性结果评定3种抗体的敏感性。根据GATA3的相关研究报道，在市场上有两家抗体供应商可供选择，一家是来自Santa Cruz的克隆HG3-31，另外一家是来自Biocare Medical的克隆L50-823。有研究[13]在相同的肿瘤中比较这两种抗体发现L50-823比HG3-31更敏感，故本研究仅选用L50-823作为研究使用的抗体。

本研究中若不涉及分子分型，GATA3在原发和配对转移性乳腺癌的表达优于GCDFP15和MGB，正如先前研究[9]报道，可是在转移性乳腺癌的敏感性为78%，而不是文献报道的95%，分子分型可能是其中一个混杂因素。GATA3在A型和B型原发和转移性乳腺癌的敏感性增加到81%～88%，明显优于GCDFP15和MGB；而且GATA3在A型和B型乳腺癌的阳性标本中显示高表达，这些结果表明GATA3与ER阳性明显相关，正如先前研究所报道[8，21]。GATA3在C型乳腺癌的敏感性也优于GCDFP15和MGB，GATA3在C型原发和配对转移性乳腺癌的敏感性分别为63%和50%，虽GATA3在转移性乳腺癌的敏感性与其它两种抗体相比，统计学分析显示没有显著差异；另外，GATA3在C型乳腺癌阳性标本显示中、低表达，这也解释了ER作为独立因素影响GATA3的调节；然而GATA3在ER阴性相关乳腺癌表现的敏感性也映射出多重ER通路影响GATA3的调节。在本论文研究中GATA3在D型乳腺癌的敏感性没有优于GCDFP15和MGB，在H-score评分界值≥50作为阳性结果的敏感性仅为13%。本研究使用IHC和FISH严格控制分子分型的筛选；H-score评分界值的设定，基底样乳腺癌患者比重大可能是影响阳性结果偏低的原因；而且GATA3在D型阳性标本中显示低表达，正好解释了其低敏感性的原因，更何况三阴癌以基底样乳腺癌为主，其来源于乳腺肌上皮细胞，肌上皮细胞本身不表达GATA3。

GATA3在原发和配对转移性乳腺癌的表达保持高度的一致，Kappa值为0.826，与研究[9]报道的结果一致；如此可以推论：如果GATA3在原发性乳腺癌表达阳性，不太可能在转移性乳腺癌表达缺失，此外，除了皮肤附属结构，使用很少出现在未知组织来源转移灶的GCDFP15和MGB作为内对照，从而支持乳腺组织来源肿瘤。

GATA3在乳腺癌分子分型的敏感性有差异；GATA3在A型和B型乳腺癌的敏感性明显优于GCDFP15和MGB，显示其高敏感性和高表达；GATA3虽在C型乳腺癌的敏感性也高于GCDFP15和MGB，可是显示其中、低表达和敏感性不稳定；GATA3在三阴癌的敏感性表现最差，与GCDFP15和MGB相比没有显示其优越性；从本论文研究结论得出：GATA3在不同分子亚型乳腺癌的诊断价值不同，应慎重选择GATA3用于三阴癌的病理诊断，GATA3在雌激素受体阴性乳腺癌的病理诊断价值有待进一步的评估。GATA3表达与ER、PR和HER2阳性有关；GATA3在原发和配对转移性乳腺癌保持高度的一致性，可以支持未知组织来源的转移性乳腺癌的诊断。GATA3的作用在乳腺癌中是否与雌激素受体一样作为预后或预测指标的独立因素还不确定，进一步阐明GATA3在乳腺癌特别是雌激素受体阴性乳腺癌和三阴癌中的功能是今后研究的方向。