miR-26b对不同分化状态神经干细胞系C17.2向肝细胞生长因子趋化迁移的影响观察

熊英，汪显耀，秦臻，田羽，王岚，潘际刚，许键炜,

(1 贵州医科大学基础医学院，贵阳550025；2 贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心；3贵阳市妇幼保健院；4贵州医科大学医学科学研究所)

神经干细胞(NSCs)是一种具有自我更新、自我复制和多向分化潜能的细胞，可被诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。胚胎发育过程中NSCs可不断迁移至特定区域分化为特定细胞，这种定向迁移能力在神经系统的发育和神经损伤修复过程中发挥重要作用[1，2]。研究[3，4]发现，在神经胶质瘤和脑损伤等病理条件下，内源或外源移植的NSCs可定向迁移至神经及脑损伤区域，通过替代受损神经元细胞或分泌神经营养因子改造损伤区域的微环境，促进受损神经元自我修复，这为中枢神经系统疾病的治疗带来了新思路。但NSCs定向迁移的具体机制至今尚未明确。Kim等[1,5]研究发现，肝细胞生长因子(HGF)可诱导NSCs的定向迁移、分化。微小RNA (miRNA)是基因表达调控在转录后水平的抑制子，参与细胞的增殖、分化和凋亡等[6]。进一步研究[7]认为，miRNA可调控干细胞调节因子的表达，在干细胞增殖、分化及迁移中起重要作用。miR-26b与miR-26a、miR-1297、miR-4465同属于miR-26家族，是调控神经干细胞分化的重要基因。目前关于miR-26b对NSCs向HGF趋化、迁移的影响相关报道较少。2017年12月～2018年5月，我们观察了不同分化状态NSCs中miR-26b的表达变化，并分析miR-26b在NSCs向HGF趋化、迁移过程中的作用，旨在为进一步阐明NSCs的定向迁移相关机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 神经干细胞系C17.2由美国Evan Y.Snyder教授馈赠。 H-DMEM、F12 DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)均购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、N2、L-谷氨酰胺、溴酚蓝、HGF均购自美国Sigma公司；TRIzol、转染试剂购自美国Ambion 公司；Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen公司；miR-26b mimic(促进miR-26b表达)、miR-26b inhibitor(抑制miR-26b表达)、miR-26b NC(对照)、miR-26b乱序对照(Con Ⅰ)及miR-26b引物均购自广州锐博生物科技公司；SYBR Green RT-qPCR 试剂盒、紫外分光光度计(NanoDrop2000)及细胞培养箱(Model311)购自美国Therom公司；超净工作台购自苏净集团，台式高速冷冻离心机(Allegra 64R)购自美国贝克曼公司，实时荧光定量PCR仪(StepOne)购自美国ABI公司，倒置相差显微镜(CKX31)购自日本Olympus公司。

1.2 HGF刺激下不同分化状态的C17.2细胞miR-26b检测

1.2.1 细胞培养、诱导分化及分组 复苏C17.2细胞，于含10% FCS、5% HS的H-DMEM中培养，当细胞汇合度90%左右时传代，用0.05%胰蛋白酶消化，终止消化后，1 000 r/min离心5 min，弃上清，按1∶3比例传代，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。培养48 h，待细胞汇合度达50% 左右时,将完全生长培养基更换为含N2和F12的诱导分化培养基，诱导C17.2分化。将细胞分为A、B、C、D组，A、B、C组分别于诱导分化12、24、72 h三个时间点终止诱导分化，获得不同分化状态的NSCs。D组为诱导分化前的细胞。

1.2.2 各组细胞miR-26b检测方法 采用实时荧光定量PCR法。取A、B、C、D组细胞，TRIzol 法提取总RNA, RQ1 RNase-Free DNase 去除基因组DNA，NanoDrop 2000检测RNA浓度。根据Revert AidTm First Strand cDNA Synthesis kit建立20 μL 反应体系，逆转录总RNA为cDNA。严格按照SYBR Green PCR 试剂盒说明书进行操作，以U6为内参。miR-26b上游引物：5′-AAGTAATTCAGGATAGGTGTCGT-3′；下游引物：5′- CCAGTGCGTGTCGTGGAT- 3′。U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′；下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。按照RT-qPCR kit建立20 μL PCR反应体系：SYB Green super mix 10 μL，FP 1 μL，RP 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6 μL。反应条件：95 ℃预变性 10 min；变性95 ℃ 10 s，60 ℃退火1 min，40个循环。以小RNA分子U6为miR-26b内参,以2-ΔΔCt代表miR-26b的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.2.3 HGF刺激下各组细胞miR-26b检测 取“1.2.1”中各组细胞，将诱导分化培养基更换为含25 ng/mL的HGF完全培养基，孵育5 h，每组均设相应对照，予以无HGF的完全培养基孵育5 h。检测各组细胞miR-26b,所有操作均同“1.2.2”，实验重复3次，取平均值。

1.3 抑制、过表达miR-26b对C17.2细胞向HGF趋化迁移的影响

1.3.1 促进miR-26b表达对C17.2细胞向HGF趋化迁移的影响观察 取对数生长期C17.2细胞，分为两组，1×105/孔接种于24孔板，每组6个复孔，生长80%～90%时用lipofectamine2000分别转染miR-26b mimic、miR-26b NC，转染48 h时RT-qPCR法检测检测miR-26b mimic、NC细胞miR-26b分别为75.44±7.17、1．00±0.10(P<0.05)，说明转染成功。将完全生长培养基更换为含N2和F12的诱导分化培养基，诱导分化，分别于诱导分化0、12、24、72 h终止诱导分化，获得不同分化状态的NSCs。采用Transwell实验检测各分化时间细胞的趋化迁移能力：将细胞稀释成2×105/mL的细胞悬液，将孔径为8.0 μm的Transwell小室置于24孔培养板中，在Transwell上室中加入细胞悬液，每孔200 μL，下室加入500 μL 含25 ng/mL HGF和10% FBS的H-DMEM，37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h，弃上室培养基，用无菌棉签擦拭上室，对下室细胞采用4%多聚甲醛进行固定，0.1% 结晶紫染色30 min，PBS漂洗后于倒置相差显微镜下拍照并测算迁移至室膜下方的细胞数，计算细胞迁移率(迁移细胞数/总细胞数×100%)。将对照组的迁移细胞数标准化定义为1。重复3次，取平均值。

1.3.2 抑制miR-26b表达对C17.2细胞向HGF趋化迁移的影响观察 取对数生长期C17.2细胞，分为两组，1×105/孔接种于24孔板，每组6个复孔，生长80%～90%时用 lipofectamine 2000分别转染miR-26b inhibitor、Con ，转染48 h时miR-26b inhibitor、Con Ⅰ细胞miR-26b相对表达量分别为0.32±0.04、1.00±0.12(P<0.05)，说明转染成功。将完全生长培养基更换为含N2和F12的诱导分化培养基，诱导分化，分别于诱导分化0、12、24、72 h终止诱导分化，采用Transwell实验检测各分化时间细胞的趋化迁移能力，计算细胞迁移率。所有操作同“1.3.1”，重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 不同分化状态C17.2细胞miR-26b相对表达量比较 A、B、C、D组细胞miR-26b相对表达量分别为1.16±0.07、1.39±0.11、2.30±0.11、1.00±0.03，与D组比较，B、C组胞miR-26b相对表达量升高，P均<0.05。

2.2 HGF处理后各组细胞miR-26b相对表达量比较 A、B、C、D组HGF处理5 h时细胞miR-26b相对表达量分别为2.02±0.43、2.28±0.35、2.50±0.41、2.21±0.23，A、B、C、D组未经处理细胞miR-26b相对表达量分别为1.21±0.12、1.47±0.21、2.30±0.20、1.00±0.04，与未经处理者比较，HGF处理5 h时A、B、D组细胞miR-26b相对表达量均升高，P均<0.05。

2.3 促进miR-26b表达后不同分化状态C17.2细胞向HGF的趋化迁移率比较 促进miR-26b表达后不同分化状态C17.2细胞向HGF的趋化迁移率比较见表1、图1。

表1 促进miR-26b表达后不同分化状态C17.2细胞向HGF趋化迁移率比较

注：与转染NC者比较，*P<0.05。

图1 转染miR-26b mimic、NC的不同分化状态>C17.2细胞迁移情况

2.4 抑制miR-26b表达后不同分化状态C17.2细胞向HGF的趋化迁移率比较 抑制miR-26b表达后不同分化状态的C17.2细胞向HGF的趋化迁移率比较见表2、图2。

表2 抑制miR-26b表达后不同分化状态C17.2细胞向HGF趋化迁移率比较

注：与转染Con Ⅰ者比较，*P<0.05。

图2 转染miR-26b inhibitor、Con Ⅰ的不同分化状态C17.2细胞迁移情况

3 讨论

NSCs具有自我更新和多向分化潜能，在一定条件下可以诱导分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，这为替代性治疗脑损伤及神经系统退行性疾病提供了可靠的细胞移植物。人体成年NSCs主要局限在嗅球、侧脑室外侧壁的脑室下区和海马齿状回的颗粒下层，在脑损伤或出现神经退行性病变时，NSCs能够特异性地向病变区域有序迁移，通过替代受损的神经元细胞或者分泌神经营养因子改造损伤区域的微环境，促进受损神经元的自我修复。NSCs的定向迁移是其发挥修复作用的前提，无论是内源还是外源移植的NSCs都需要经过一定距离的迁移到达脑损伤的特定区域，然后再发挥其修复功能[8]。然而，在神经干细胞移植治疗脑损伤的研究中发现，移植在脑损伤区域周围的NSCs只有少部分能够迁移到损伤区域[9]，这是制约干细胞移植疗效的重要原因，成为目前NSCs移植治疗中亟待解决的问题。NSCs的定向迁移和分化是个复杂而精准的过程，具体机制尚未阐明，因此深入了解其相关分子机制，寻找提高移植细胞迁移效率的方法，是改善疗效的关键。

研究[10，11]表明NSCs的定向迁移和分化受到趋化因子以及miRNA等多因素的调控。随着研究的深入，多种炎症因子包括HGF、基质细胞衍生因子、干细胞因子、白介素等对NSCs趋化迁移的影响逐渐被认识。其中，HGF是一种旁分泌的多能性细胞因子，Takano等[5]研究表明，HGF是促进NSCs的增殖和成神经分化的关键因子，脊髓损伤区域的HGF分泌增加，能有效的促进NSCs移植后神经功能的恢复。魏友华等[12]研究表明，HGF参与调控了NSCs的趋化迁移，并且NSCs趋向HGF迁移的能力与其分化状态密切相关，适当的诱导分化状态下，NSCs具备更强的趋化迁移能力。因此本研究以HGF为趋化诱导因子，并将NSCs进行了不同时间的诱导分化，进一步研究影响其趋化迁移的可能相关机制。

miRNA在细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移过程中发挥重要作用。miR-26家族在胎儿脑发育、肌肉分化以及人间充质干细胞增殖中起重要作用[13～15]。此外，miRNA的失调与部分神经退行性疾病密切相关，Absalon等[16]研究证实,阿尔茨海默病患者脑内病灶区的miR-26b表达在疾病早期就开始增加，miR-26b靶向与该疾病密切相关的几种蛋白，参与了疾病的病理过程。正常生理状态下NSCs维持相对静止的状态，当神经系统发生损伤后病变区域微环境的改变，是促使NSCs的定向迁移的重要因素，为了研究miR-26b是否参与调控NSCs的定向迁移，本研究检测了不同分化状态NSCs的miR-26b表达水平，并比较了HGF对不同分化状态NSCs中miR-26b表达水平的影响，提示miR-26b的表达在NSCs分化过程中呈逐渐上调的趋势，HGF的刺激能够上调NSCs中 miR-26b的表达。此外，通过Transwell实验从细胞群体水平，观察了NSCs转染miR-26b mimic后向HGF的趋化迁移情况，结果表明过表达miR-26b能够显著提高NSCs的趋化迁移能力，尤其是诱导分化12 h和1 d的NSCs。为了验证上述结果，进一步通过转染miR-26b inhibit下调NSCs中miR-26b的表达后行Transwell实验，发现各分化状态NSCs的迁移效率显著降低，反向论证了miR-26b参与NSCs定向迁移的调控，且其调控作用与细胞的分化状态有关。

综上所述，不同分化状态C17.2细胞miR-26b表达均上调。在HGF刺激下，促进miR-26b表达的C17.2细胞定向迁移能力更强。miR-26b可促进不同分化状态的C17.2细胞向HGF的趋化迁移。但由于miR-26b有多个靶标基因，广泛地参与了神经元分化，细胞增殖、凋亡等细胞生物学过程，其调控NSCs定向迁移的具体靶基因及相关信号通路更有待进一步研究阐明。