乳腺癌患者血清miR-765，miR-200b水平检测及与临床病理学相关研究*

洪 宏，袁建芬，喻海忠

(南通市中医院检验科，江苏南通 226001)

乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤。高发病率、致死率，严重威胁女性身体健康[1]。早期确诊是提高患者生存率的关键。近年来，有大量研究表明，多种血清微小RNA(miRNA，miR)的异常表达与乳腺癌的发生、发展密切相关，对乳腺癌的早期诊断、预后评估、治疗等都有非常重要的意义[2，3]。miR-765和miR-200b参与乳腺癌的发生、发展[4，5]，但联合检测在乳腺癌诊断的临床价值及其与各临床病理特征间的关系还缺乏相关性研究。本研究应用实时荧光定量PCR的方法检测乳腺癌患者血循环miR-765和miR-200b的表达情况，并进行价值和相关性探讨，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取本院2014年4月～2018年1月收治的初诊乳腺癌患者58例(乳腺癌组)，平均年龄48.2±7.1岁；乳腺良性疾病患者28例(乳腺良性疾病组)， 包括乳腺纤维腺瘤、囊性增生及乳头状瘤，平均年龄47.4±6.2岁。上述诊断均通过术前穿刺病理检查或术后病理切片确诊，临床病理资料完整，且均为女性。另选取30例健康体检妇女为对照组，并排除肝肾、心血管及乳腺等疾病，平均年龄48.7±7.2岁。各组在年龄、性别上差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 试剂和仪器 Cobas z 480荧光PCR仪采用瑞士Roche公司的产品，RNA提取使用美国Invitroge公司的产品，PCR试剂分别使用TaqMan MicroRNA RT kit试剂盒，TaqMan MicroRNA assay和QuantiTect SYBR®Green PCR Kits。

1.3 方法 分别采集患者术前及健康体检者空腹静脉血3 ml，静置30 min，1 500 g离心15 min分离血清，上清液于EP管中-70℃保存备用。RNA提取使用Trizol法，按试剂盒操作说明进行。用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm波长下的光密度值，若A260nm/280nm在1.8～2.2间认为合格，RNA溶液无杂质，可进行RNA逆转录。根据TaqMan MicroRNA RT kit操作说明书进行RT-PCR，生成的cDNA置于-70℃保存。以实时荧光定量PCR仪进行如下扩增反应，U6为内参，miR-765反应体系TaqMan MicroRNA assay如下： cDNA 1 μl，2×Master mix 10 μl，PCR primer 0.5 μl，20×SYBRI 1 μl，H2O 7.5 μl，共20 μl；U6体系中除去PCR primer，H2O增至 8 μl。反应条件：95℃ 10 min→95℃ 15 s→60℃ 30 s，70℃ 90 s(40个循环)，溶解曲线1个循环。miR-200b反应体系QuantiTect SYBR®Green PCR Kits如下：cDNA 2 μl，2×QuantiTect SYBR Green PCR Master mix 10 μl，10×miScript Universal primer 2 μl，10×miScript primer assay 2 μl，H2O 4 μl，共20 μl；U6体系同上。反应条件：95℃15 min→94℃15 s→55℃30 s，70℃30 s(40个循环)，溶解曲线1个循环。由2-△Ct计算得出miR-765，miR-200b的相对表达量。

2 结果

2.1 不同组间血清miRNA相对表达水平比较 见表1。乳腺癌组血清miR-765和miR-200b的相对表达量显著低于乳腺良性疾病组(t=3.955，2.657，P<0.05)，亦低于健康对照组(t=4.465，3.518，P<0.05)；乳腺良性疾病组miR-765和miR-200b的相对表达量均略低于健康对照组，两组miR-765表达差异有统计学意义(t=0.872，P<0.05)，miR-200b表达差异无统计学意义(t=3.253，P>0.05)。

表1 不同组间血清miRNA相对表达水平比较

2.2 血清miR-765和miR-200b的Logistic回归分析 见表2。设自变量X1=miR-765，X2=miR-200b，得联合检测的因变量Y(miR-765&miR-200b)=9.923X1+19.901X2。通过模型中的概率值来拟合得ROC曲线的AUC为0.952，灵敏度和特异度均较好。

表2 miR-765与miR-200b相对表达量单独与联合检测对乳腺癌的诊断价值

2.3 miR-765，miR-200b的相对表达量与乳腺癌临床病理特征的关系 见表3。miR-765在乳腺癌患者血清中的表达与患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和Cerb-B-2均无明显相关(t=0.548，0.475，2.653，0.302，0.418，2.014，均P>0.05)，只与TNM分期相关(t=3.222，P<0.05)；而miR-200b在乳腺癌患者血清中的表达亦与患者的年龄、肿瘤大小、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和Cerb-B-2均无明显相关(t=2.367，1.939，0.7773，0.519，2.301，均P<0.05)，与TNM分期、淋巴结转移明显相关(t=1.855，3.987，均P<0.05)。

表3 miR-765，miR-200b的相对表达量与乳腺癌临床病理特征的关系(n=58)

3 讨论

miRNA是一类约为18～26个核苷酸长度的小分子非编码RNA，通过与目标mRNA完全或不完全互补结合的方式，降解目标mRNA，或抑制其翻译，参与基因转录和表达，对细胞的发育、增殖、分化和凋亡等起调控作用[6～8]。miRNA作为调节子在乳腺癌发生、发展中发挥着重要作用。最近有研究发现，miRNA可以通过表达异常、作用靶基因不同，来作为促癌或抑癌基因进而调控乳腺癌进程，已成为目前研究的热点之一。临床研究中，我们期望找到更多的关于miRNA用于乳腺癌诊断、预后等方面的新思路和新方法，对提高乳腺癌的诊疗具有重要意义。血清miR-765检测对乳腺癌的诊断已显现出一定的价值，联合检测可以优势互补，提高效率，是肿瘤早期诊断的趋势[9]。

本研究发现，乳腺癌患者血清中miR-765与miR-200b表达水平显著降低，提示其血清水平低表达可能作为乳腺癌诊断的潜在生物标志物。进一步评估miRNA-765和miRNA-200b表达对乳腺癌诊断的价值，分析了单独miR-765与miR-200b和两者联合检测的ROC曲线，发现血清miR-765与miR-200b的表达对乳腺癌的诊断具有较高的AUC值，分别为0.843，0.897；联合检测的AUC值为0.952，优于单一使用miR-765或miR-200b来诊断乳腺癌。单独检测时，miR-765与miR-200对乳腺癌的诊断敏感度较好，分别为87.9%，94.8%，但特异度均不足，分别为81.0%，74.1%，两者联合检测大大提高了对乳腺癌诊断的特异度(93.1%)。两者与目前研究比较多的miR-21在乳腺癌患者血清中的表达(ROC曲线下面积为0.828，敏感度和特异度分别为80%和70%)相比较优[10]。进一步分析，乳腺癌患者血清中miR-765和miR-200b表达水平与临床病理特性相关性发现，TNM分期越高则miR-765和miR-200b表达水平越低，提示两者可能作为抑癌基因参与乳腺癌的进展；远处淋巴结转移者miR-200b表达低于无淋巴结转移者，提示miR-200b低表达可能促进乳腺癌侵袭及迁移。而两者表达与患者的年龄、肿瘤大小、ER表达、PR表达及Cerb-B-2表达无相关性，提示miR-765和miR-200b表达不易受个体因素等影响，是乳腺癌早期诊断和预后评估的潜在标志物。但值得注意的是，多种恶性肿瘤均具有低表达，特异度较差。因此，联合其他血清学检测可能对提高特异度有所帮助。

综上所述，乳腺癌患者血清miR-765与miR-200b的表达均下调，联合检测对乳腺癌的诊断具有潜在的临床应用价值，可作为临床上一种辅助诊断的方法，与临床病理特征具有一定的相关性，可用于预后评估。