河南省小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性

徐建强，张 勇，平忠良，孙 迪，刘鹏飞，杨 霞，李慧凯，曹 瑜 ，林晓民

(1.河南科技大学林学院，河南洛阳 471003; 2.安徽省农科院植物保护与农产品质量安全研究所，安徽合肥 230031)

由禾谷镰孢菌复合群(Fusariumgraminearumspecies complex，FGSC)引起的小麦赤霉病，一直是中国江淮流域、西南冬麦区及东北春麦区最主要的小麦病害之一[1]。近年来，由于全球气候变化和耕作制度的调整，赤霉病的发生在我国有北扩西移的趋势，山东、河南、陕西等省麦区小麦赤霉病的流行频率有所增加，发生程度加重[2]。赤霉菌不仅影响小麦产量，其在小麦中产生的镰刀菌毒素还危害人畜健康[3-4]。目前，对小麦赤霉病的生物防治措施仍不完善，小麦品种赤霉病抗源匮乏，培育抗病品种困难重重[5-6]。小麦赤霉病的防治仍以化学防治为主，但是病菌已对防治赤霉病的主要药剂—多菌灵产生了严重的抗药性，且抗药性群体有随着种子调运及联合收割机跨区作业等方式从抗药性发生较早的江淮麦区北向山东、河南，西向湖北、四川扩散的趋势[7-8]。

戊唑醇为三唑类杀菌剂，可引起小麦赤霉病菌菌丝形态和结构的明显畸形[9]。室内试验发现，戊唑醇处理后小麦赤霉病菌菌丝末端分枝增多，新生菌丝伸长受阻，菌丝体局部膨大，有时可见菌丝及芽管的消解[10]；此外，戊唑醇喷施可推迟麦穗上分生孢子的萌发，引起芽管畸形，不能形成侵染菌丝，严重影响病菌的侵染过程[11]。Yin等[12]、叶 滔等[13]及宋阳阳等[14]测定小麦赤霉病菌对戊唑醇敏感性的结果均显示，戊唑醇对小麦赤霉病菌菌丝生长有很高的抑制作用。戊唑醇不但在温室及田间对赤霉病有较好的防效，而且还能促进小麦增产[15]。目前，尽管已有河南省小麦赤霉病菌对戊唑醇敏感性的报道，但所用菌株仅为个别地区菌株，难以反映河南省的总体情况；而同一省份不同地市菌株对同一药剂的敏感性存在着很大差异[16]。目前，尚未有河南省小麦赤霉病菌群体对戊唑醇敏感性的系统报道。为明确当前河南省小麦主产区赤霉病菌对戊唑醇的敏感性现状，本研究采用菌丝生长速率法测定了2016年从河南省11个地市分离的小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性，建立敏感基线，分析不同地区菌株的敏感性差异，以期为戊唑醇在河南省小麦赤霉病防治中的合理利用提供依据，为病原菌对药剂的敏感性监测提供信息。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2016年4-5月从河南省各地市大面积种植小麦的乡镇采集染病麦穗，带回实验室后采用组织分离法，从小麦穗轴病健交界处分离赤霉病菌；如果麦穗上有粉红色霉层或籽粒变瘪，也可以从染病麦粒上直接分离；待长出生长一致的菌落后，转入3%绿豆汤培养液里摇培，5 d后挑单孢，通过形态学鉴定共获得小麦赤霉病菌单孢分离菌株 113株(表1)。

1.2 供试药剂

98%戊唑醇(tebuconazole)原药，广西田园生化股份有限公司生产；97.9%的咯菌腈(fludioxonil)原药，先正达(中国)投资有限公司生产；98%多菌灵(Carbendazim)原药，山东省双星农药厂生产。多菌灵原药预溶于0.1 mol·L-1稀盐酸中，戊唑醇和咯菌腈原药预溶于甲醇中，均配制成1.0×104μg·mL-1的母液，放于4℃冰箱中备用。

表1 供试菌株采集信息Table 1 Tested isolates in the study

1.3 戊唑醇对小麦赤霉病菌的最低抑制浓度测定

随机选取LYMJ-1、LYMJ-2、SQSY-1及LHLY-4四个菌株，进行戊唑醇对赤霉病菌最低抑制浓度(minimum inhibition concentration,MIC)测定，采用菌丝生长速率法进行[17]。将供试菌株在PSA平板上25 ℃培养3 d后，用打孔器在菌落边缘制成直径5 mm的菌饼，菌丝面朝下接入含0.5、1.0、2.0及4.0 μg·mL-1戊唑醇的PSA平板上，以不含药剂的平板作对照[17]；每处理3次重复，于25℃下黑暗倒置培养3 d，采用十字交叉法测量菌落直径，计算各浓度药剂的菌丝生长抑制率。以全部供试菌株菌丝生长受到抑制的最小浓度作为戊唑醇对小麦赤霉病菌的最低抑制浓度。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径平均值-处理菌落直径平均值)/(对照菌落直径平均值-菌饼直径)×100%

1.4 小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性测定

试验方法同1.3，戊唑醇浓度设置为0.031 25、0.062 5、0.125、0.250、0.50及1.0 μg·mL-1，培养3 d后计算各浓度下的菌丝生长抑制率，利用EXCEL 2007和DPS 6.55软件插件中的“数量型数据机值分析”计算药剂抑制菌丝生长的毒力回归方程、相关系数R和有效中浓度(EC50)。

1.5 敏感性分布图绘制及敏感性基线的确定

参照徐建强等[18]的方法，将病菌群体对供试药剂的敏感性从低到高分成几个区间，统计每个区间的菌株数和频率，以每个区间的EC50中值为横坐标，菌株频率为纵坐标，制作病菌对戊唑醇的敏感性频率分布图。对所有EC50值利用DPS 6.55软件进行Shapiro-Wilk正态性检验[16]。

1.6 不同地区菌株对戊唑醇敏感性差异的分析

采用最小显著差异法(least significant difference,LSD)对戊唑醇对各县市菌株的毒力进行单因素差异显著性分析[16]；每地随机选择3株，共33株病菌(表1)，采用SPSS 20.0对戊唑醇抑制病菌菌丝生长的EC50值进行聚类分析[19]。

1.7 小麦赤霉病菌对戊唑醇和对多菌灵、咯菌腈敏感性的相关性分析

采用菌丝生长速率法[19]。从分离菌中选取对戊唑醇敏感性不同的菌株，测定其对咯菌腈的敏感性，浓度设置为0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1；测定其对多菌灵的敏感性，浓度设置为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.8 μg·mL-1。试验及数据处理方法同1.3及1.4。参照李波涛等[20]的方法判断病菌对戊唑醇和对多菌灵、咯菌睛敏感性的相关性。

2 结果与分析

2.1 戊唑醇对小麦赤霉病菌菌丝生长的MIC

由图1可知，0.5 μg·mL-1戊唑醇对四株病菌的菌丝生长抑制率已在85%以上；随着戊唑醇浓度的升高，菌丝生长抑制率逐渐增大；戊唑醇浓度达到4.0 μg·mL-1时，四个菌株则全部不生长。由此可知，戊唑醇对赤霉病菌菌丝生长的最低抑制浓度为4.0 μg·mL-1。不同菌株对戊唑醇的敏感性不同。

图1 戊唑醇对小麦赤霉病菌菌丝生长的MICFig.1 MIC of tebuconazole to mycelial growth of Fusarium graminearum

2.2 小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性及敏感基线

供试113株病菌对戊唑醇的敏感性基本呈连续性分布，EC50的变化范围为0.010～0.237 μg·mL-1，最大值为最小值的24.19倍；平均EC50值为0.057±0.041 μg·mL-1(图2A，表2)。Shapiro-Wilk正态性检验结果显示，供试菌株对戊唑醇的敏感性频率不符合正态分布(W=0.779，P<0.05)，但有 81.4% 的菌株(92株)集中位于图2B中相应的主峰范围内，呈近似正态分布(W=0.974，P=0.067>0.05)，其敏感性频率分布为连续单峰曲线，因此将其EC50平均值0.041±0.016 μg·mL-1作为小麦赤霉病菌对戊

唑醇的敏感性基线。

2.3 不同地区小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性

由表2可知，同一县市菌株对戊唑醇的敏感性差异较大，洛阳市洛龙区菌株差异最大，EC50最大值和最小值比达到14.40；其次为漯河临颍，二者比值达到12.60；而郑州巩义菌株间敏感性差异最小(1.10)；其余大部分地区菌株EC50最大与最小比值为1.32～7.65。

除周口沈丘及洛阳孟津菌株外，其余9个县市间菌株对戊唑醇的敏感性差异不显著。戊唑醇的平均EC50值变化范围为0.038～0.101 μg·mL-1，其中，洛阳孟津菌株最为敏感，而周口沈丘菌株最不敏感，两地菌株EC50平均值比值为2.66。各地区菌株的平均EC50值比较，洛阳孟津、商丘睢阳、信阳平桥、驻马店泌阳、郑州巩义五地菌株对戊唑醇的敏感性高于河南省平均水平；其他地区菌株对戊唑醇的敏感性低于河南省平均水平。

2.4 不同地区菌株对戊唑醇敏感性水平的系统聚类分析

根据33个小麦赤霉病菌菌株的EC50值，可将其分为5类(图3)，所包括的菌株数分别为18、3、2、8及2个。除郑州巩义、洛阳孟津及商丘睢阳的菌株全部聚在第Ⅰ类外，其余县市的菌株均出现在不同的类中，说明同一县市的菌株对戊唑醇敏感性差异较大，而不同县市菌株对戊唑醇敏感性差异不明显，这与LSD法的分析结果一致，说明小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性差异与菌株来源无明显相关性。

图2 小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性(A)及频率分布(B)Fig.2 Sensitivity(A) and frequency(B) of Fusarium graminearum to tebuconazole表2 河南省不同地区小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性Table 2 Sensitivity of Fusaium graminearum to tebuconazole from different areas in Henan Province

采集地点Sampling siteEC50范围Range/(μg·mL-1)EC50(Max.)/EC50(Min.)均值±标准差Mean±SD/(μg·mL-1)敏感性指数Toxicity index漯河临颍 Linying County,Luohe0.010～0.12612.600.055±0.037abc0.96洛阳洛龙 Luolong District,Luoyang 0.015～0.21614.400.065±0.048ab1.14洛阳孟津 Mengjin County,Luoyang 0.031～0.0451.450.038±0.006c0.67南阳方城 Fangcheng County,Nanyang 0.034～0.0902.650.060±0.028abc1.05平顶山叶县 Ye County,Pingdingshan 0.045～0.0791.760.059±0.015abc1.04商丘睢阳 Suiyang District,Shangqiu 0.037～0.0491.320.041±0.005bc0.72新乡延津 Yanjin County,Xinxiang 0.041～0.0741.800.052±0.019abc0.91信阳平桥 Pingqiao District,Xinyang 0.020～0.0673.350.040±0.015bc0.70周口沈丘 Shenqiu County,Zhoukou 0.031～0.2377.650.101±0.068a1.77驻马店泌阳 Biyang County,Zhumadian 0.013～0.0705.380.042±0.017bc0.74郑州巩义 Gongyi City,Zhengzhou 0.039～0.0431.100.041±0.002bc0.72总计 Total0.010～0.23723.700.057±0.041abc1.00

同列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著。

Different letters following data in same column indicate significant difference at 0.05 level.

图3 不同地理来源菌株对戊唑醇敏感性水平的系统聚类分析Fig.3 Hierarchical cluster analysis on EC50 values of tebuconazole to Fusarium graminearum

2.5 小麦赤霉病菌的戊唑醇、咯菌腈、多菌灵敏感性相关性分析

戊唑醇对77株(随机选取，对戊唑醇抗性不同)小麦赤霉病菌的EC50均值为0.059±0.041 μg·mL-1，咯菌腈对77株小麦赤霉病菌的EC50均值为0.010±0.011 μg·mL-1，二者的EC50值线性回归方程为y=0.123x+0.003，b为正值，P<0.05，差异显著；但决定系数(R2)为0.212，小于0.8，说明小麦赤霉病病菌对戊唑醇与咯菌腈的敏感性间无相关性。

戊唑醇对67株(随机选取，对戊唑醇抗性不同)小麦赤霉病菌的EC50均值为0.066±0.046 μg·mL-1，多菌灵对67株小麦赤霉病菌的EC50均值为0.403±0.119 μg·mL-1，二者的EC50值线性回归方程为y=-0.240x+0.418，b为负值，P<0.05，差异显著；但决定系数(R2)为0.008，小于0.8，说明病菌对戊唑醇与多菌灵的敏感性间无相关性。

图4 小麦赤霉病菌对戊唑醇与其对咯菌腈、多菌灵敏感性之间的相关性Fig.4 Correlation of the susceptibility of Fusarium graminearum between tebuconazole and fludioxonil,or carbendazim

3 讨 论

Yin等[12]测定了40株禾谷镰孢菌及116株亚洲镰孢菌对戊唑醇的敏感性，基线分别为0.248和0.316 μg·mL-1。叶 滔等[13]测定了采自河南、山东、河北三省的120株病菌对戊唑醇的敏感性，建立的敏感性基线为0.103 μg·mL-1。宋阳阳等[14]测定了采自湖北省的100株病菌对戊唑醇的敏感性，敏感性基线为0.181 μg·mL-1。本研究中，小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性基线为0.041 μg·mL-1，小于以上结果。这可能是由于菌株地理来源、供试菌株数目、用药时间长短不同造成的。Yin等[12]所测得的敏感性基线值最高，这可能是由于其所用菌株多采自江苏、浙江地区，小麦赤霉病在这些地区发生时间长，发病重，菌源数量大，用药时间长，用药水平较高，从而导致病菌对药剂的敏感性有所降低。

叶 滔等[21]通过紫外诱变获得了小麦赤霉病菌对戊唑醇的抗药性菌株，表明病菌对戊唑醇可能具有抗性风险，但突变体获得抗药性的同时伴随着生长繁殖能力的下降；戊唑醇与苯醚甲环唑、多菌灵、异菌脲、百菌清和福美双均无交互抗性。本研究结果表明，小麦赤霉病菌对戊唑醇与其对多菌灵、咯菌腈的敏感性间无相关性。这为进行戊唑醇和其他药剂的复配来对小麦赤霉病实施化学防治提供了参考。

当前河南省小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性不符合正态分布，已出现了敏感性下降的亚群体，但菌株数量较少，所占频率较低，这说明河南省小麦生产中仍然可使用戊唑醇进行小麦赤霉病的化学防治，也可以通过同其他药剂复配来延缓抗性的发展。但为了追踪病菌对药剂的敏感性变化情况，生产中应持续监测小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性。