块菌多糖复合酶法提取工艺优化

清 源陈甜甜,2

QING Yuan1 CHEN Tian-tian1,2

(1. 西昌学院农业科学学院，四川 西昌 615013；2. 西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610000)

(1. Department of Agricultural Science of Xi Chang University, Xichang, Sichuan 615013, China; 2. School of Food and Bioengineering of Xihua University, Chengdu, Sichuan 610000, China)

块菌(Truffles)又名松露、无娘果等，属于块菌科(Tuberaceae Dumort)块菌属(TuberMicheli)。块菌中富含氨基酸、蛋白质、维生素、雄烷醇、微量元素等生理活性成分，具有提高机体免疫力、抗肿瘤等保健功效，是典型的药食同源真菌[1-3]。中国商业块菌品种包括印度块菌(T.indicum)、夏块菌(T.aestivum)等，主要产自西南山区的四川和云南[4-6]。研究[7-9]表明，块菌的很多生物学功效都与其多糖密切相关。

目前，常用的多糖提取方法主要有热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法、酶法等[10]。利用不同方法制备多糖的得率、糖含量、单糖组分等大不相同[11]。其中，热水浸提法耗时长、提取效率低，且液体量太大不宜处理；微波和超声波辅助提取，不仅会影响多糖空间微结构，也容易导致多糖化学键断裂和相对分子质量降低，从而对多糖的抗氧化等生物学活性造成影响[12-13]。目前，利用生物酶提取多糖的方法已经得到广泛应用，此法具有成本低和使用方便的优点[14]，与超声波和微波辅助提取方法在大规模生产时的局限性相比，其反应条件温和，对多糖结构的破坏较少，对设备和工艺的要求也较低。此前已有酶解提取块菌多糖的研究，但均采用单一酶法辅助提取[15-16]。

由于不同的酶作用位点不同，复合酶解作用效率更高[17]。通常多糖被包裹在植物细胞壁内，纤维素酶能破坏细胞壁，使多糖易于从胞内释放。蛋白酶对细胞中游离的蛋白质具有分解作用，并水解糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质，有利于多糖的浸出。本研究选用中性蛋白酶和纤维素酶辅助提取块菌多糖，并采用均匀试验设计法优选复合酶解工艺，以期获得高效温和的提取条件，避免超声波或微波对多糖结构与活性的影响，为块菌多糖结构和功能的进一步研究提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

印度块菌：购自四川会东；

纤维素酶(3 units/mg)、中性蛋白酶(60 000 U/g)：北京索莱宝科技有限公司；

盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、混合磷酸盐、邻苯二甲酸氢钾等：分析纯。

1.2 仪器

电热恒温鼓风干燥箱：GZX-9023MBE型，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；

粉碎机：DC-200型，浙江武义鼎盛日用金属制品厂；

紫外可见分光光度计：TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；

pH计：PHS-3C型，上海精密仪器仪表有限公司；

恒温水浴锅：HW.SY21-K4C型，北京市长凤仪器仪表公司；

分析天平：ME204型，梅特勒-托利多仪器(中国)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖提取工艺

块菌→干燥(55 ℃)→粉碎(过60目筛)→干粉→加蒸馏水→调pH→酶解→沸水灭酶(10 min)→冷却→真空抽滤→滤液→沉淀物二次提取→合并2次滤液→定容(80 mL)→块菌粗多糖溶液→苯酚-硫酸法测多糖含量

1.3.2 单因素试验设计

(1) 酶配比对块菌多糖得率的影响：设定酶用量为2.5%，酶解时间65 min，酶解温度55 ℃，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探讨酶配比(中性蛋白酶∶纤维素酶)分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/g)时对块菌多糖得率的影响。

(2) 酶解时间对块菌多糖得率的影响：设定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解温度55 ℃，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探讨酶解时间分别为45，65，85，105，125 min 时对块菌多糖得率的影响。

(3) 酶解温度对块菌多糖得率的影响：设定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解时间65 min，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探讨酶解温度分别为45，50，55，60，65 ℃时对块菌多糖得率的影响。

(4) 酶用量对块菌多糖得率的影响：设定酶配比1∶4 (g/g)，酶解时间65 min，酶解温度55 ℃，酶解pH值6.0，料液比1∶40 (g/mL)，探讨酶用量分别为1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%时对块菌多糖得率的影响。

(5) 酶解pH值对块菌多糖得率的影响：设定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解时间65 min，酶解温度55 ℃，料液比1∶40 (g/mL)，探讨酶解pH值分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5时对块菌多糖得率的影响。

(6) 料液比对块菌多糖得率的影响：设定酶配比1∶4 (g/g)，酶用量2.5%，酶解时间65 min，酶解温度55 ℃，酶解pH值6.0，探讨料液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)时对块菌多糖得率的影响。

1.3.3 均匀设计试验 根据单因素试验结果，按照U10(108)进行均匀设计试验，得出块菌多糖的最佳复合酶解工艺。

1.3.4 块菌多糖含量的测定 采用硫酸-苯酚法[18]。

(1) 葡萄糖标准曲线的绘制：以标准葡萄糖溶液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为Y=6.425 7X+0.291 7，R2=0.999 5。

(2) 块菌多糖含量的计算：

(1)

式中：

A——块菌多糖含量，%；

Y——块菌多糖溶液浓度，mg/mL；

V——多糖溶液体积，mL；

n——稀释倍数；

N——多糖粗提物质量，g。

1.3.5 块菌多糖得率的计算

(2)

式中：

B——块菌多糖得率，%；

Y——块菌多糖溶液浓度，mg/mL；

V——多糖溶液体积，mL；

n——稀释倍数；

M——块菌干粉质量，g。

1.3.6 试验统计与分析 运用DPS 9.50软件对均匀试验结果进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶配比对多糖得率的影响 由图1可知，块菌多糖得率随中性蛋白酶与纤维素酶配比的逐渐增大先升高，在1∶4 (g/g)时达到最高，之后呈现下降趋势。纤维素酶能有效地分解或破坏细胞壁，中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而更有利于多糖的提取[19]。故提取块菌多糖的最适酶配比为1∶4 (g/g)。

2.1.2 酶解时间对多糖得率的影响 由图2可知，随着酶解时间的延长，多糖得率提高，在65 min处达到最大，之后再延长时间，多糖得率下降。酶解时间太短，底物不能被充分酶解；时间太长，高温使得被提取出来的多糖分解，或者高温导致多糖结构发生变化，从而使多糖得率降低。提取块菌多糖的最佳酶解时间为65 min。

图1 酶配比对多糖得率的影响

图2 酶解时间对多糖得率的影响

2.1.3 酶解温度对多糖得率的影响 由图3可知，块菌多糖的得率随着温度的升高先增加，在55 ℃处达到最大，之后呈下降的趋势。因温度较低时，达到反应所需的活化能较困难，因而反应速度较慢，多糖的得率也较低；当温度较高时，酶活性丧失，反应速率减慢，多糖得率也低。故提取块菌多糖的最合适酶解温度为55 ℃。

2.1.4 酶用量对多糖得率的影响 由图4可知，块菌多糖的得率随酶用量的增加先增加，在2.5%处达到最大，之后多糖得率减少。因酶用量较低时，2种酶不能完全使结合在一起的多糖和蛋白质分开，因而多糖提取率较低；当酶用量较高时，由于酶分子已经达到饱和，一部分酶分子不能与底物结合，底物被水解的速率下降，多糖得率减少。故提取块菌多糖的最适酶用量为2.5%。

图3 酶解温度对多糖得率的影响

图4 酶用量对多糖得率的影响

2.1.5 pH值对多糖得率的影响 由图5可知，pH值从4.5增加至6.0块菌多糖的得率随之增加，当pH值为6.0时块菌多糖的得率达到最高，之后开始降低。因pH较低时，中性蛋白酶的活性受到抑制；同样当pH>6.0时，纤维素酶的活性受到抑制。故提取块菌多糖的最适pH值为6.0。

图5 pH值对多糖得率的影响

2.1.6 料液比对多糖得率的影响 由图6可知，块菌多糖的得率随料液比的增加呈先上升的趋势，在1∶40 (g/mL)处达到最大值，随后开始下降。可能是当料液比较小时，短时间内多糖的浸出受到抑制，所以得率较低；而料液比较大时，水分的增加使酶的浓度降低，多糖得率也会降低[8]。故提取块菌多糖的最合适料液比为1∶40 (g/mL)。

图6 料液比对多糖得率的影响

2.2 均匀试验

2.2.1 均匀设计 根据单因素试验结果，选择酶配比、酶解时间、酶解温度、酶用量、pH值和料液比6个因素的较优水平(见表1)，按照U10(108)设计进行均匀试验。

2.2.2 均匀试验结果与分析 按照优化之后的数据点，每次提取块菌干粉1.0 g，根据选定的均匀设计表，得出试验结果见表2。运用DPS 9.50软件进行二次多项式回归分析得到回归方程为：

(3)

对建立的模型进行检验可知，F=3 240.488 6>>F0.01(7,2) =99.34, P=0.000 3，说明结果显著(P<0.05)。复相关系数R=0.999 956，剩余标准差SSE=0.009 4。说明该模型与实际试验拟合度高，能很好地拟合复合酶法提取块菌多糖的工艺条件，方程有意义。

表1 均匀设计试验因素与水平表

表2 均匀设计试验结果

表3 相关系数及检验结果

同时，用DPS软件进行分析得到复合酶法提取块菌多糖的最优条件为：酶配比1∶7.03 (g/g)，酶解时间47.60 min，酶解温度41.29 ℃，酶用量为底物浓度的3.62%，pH值4.79，料液比1∶29.08 (g/mL)时，块菌多糖的理论得率为14.98%。

2.3 最佳工艺的确定及验证

为操作方便，设置最佳提取工艺条件为：酶配比1∶7 (g/g)，酶解时间48 min，酶解温度41 ℃，酶用量为底物浓度的3.6%，pH值4.8，料液比1∶29 (g/mL)。按上述条件进行验证，实验重复3次。

经验证，优化条件下提取的块菌多糖得率为14.50%，比均匀试验中的10组试验结果都高，说明优化结果具有指导意义。但是与回归模型的预测值14.98%有一定的误差，相对误差为3.3%。在此条件下，块菌多糖含量可达75.96%。与前人[15,20]研究相比，该块菌多糖提取温度更低，时间更短，耗能更少，提取效率更高。

2.4 不同提取方法的比较

不加酶的对照试验，提取的块菌多糖得率仅为9.45%，复合酶法与之相比提高了53.44%；单一使用中性蛋白酶和纤维素酶的多糖得率仅为10.87%和11.43%。说明均匀设计优化多糖提取条件稳定性好，且非常可靠，可用于复合酶法提取块菌多糖。

3 结论

本研究通过单因素和均匀设计试验，得出块菌多糖最佳提取工艺条件为：酶配比1∶7 (g/g)，酶解时间48 min，酶解温度41 ℃，酶用量3.6%，酶解pH值4.8，料液比1∶29 (g/mL)，块菌多糖的得率可达14.50%，多糖含量可达75.96%。应用此条件提取块菌多糖稳定可靠，提取时间短，还节能减排，可为块菌多糖的开发利用提供参考。但是，本研究方法所得块菌多糖的纯化、结构鉴定及其生物活性等还有待进一步研究。