长链非编码RNA结肠癌相关转录本2在胃癌血清中的表达及临床意义*

孙晓杰 郭红艳 吴 琦 齐晓丹 徐 晶 黄常志 张春晶△

(齐齐哈尔医学院,1 临床生化教研室,2 生物化学教研室,齐齐哈尔 161006;3 国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室,北京 100021)

长链非编码RNA结肠癌相关转录本2(colon cancer associated transcript 2,CCAT2)于2013年被发现,该基因定位于人类染色体8q24.21[1]。研究表明,CCAT2具有癌基因的功能,其在人类结肠癌[2]、胃癌[3]、乳腺癌[4]及卵巢癌[5]等多种肿瘤组织中均表达增高,与肿瘤细胞的生长增殖和侵袭转移等生物学行为密切相关。但CCAT2在肿瘤患者血清中是否表达以及血清表达水平与肿瘤临床病理特征的相关性却未见报道。本研究采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测了胃癌患者和健康对照者血清CCAT2的相对表达量,分析CCAT2的表达与胃癌临床病理特征的相关性,初步探讨CCAT2作为血清学诊断标志物对胃癌的临床诊断效能及意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象

本研究所用血清样本包括胃癌患者117例和正常对照100例,均取自2017年3～6月在中国医学科学院肿瘤医院住院的胃癌患者和健康体检者。全部胃癌样本在收集前均未进行手术、放疗和化疗等相关治疗,癌症病例经病理诊断证实,根据手术结果按照美国癌症联合委员会关于癌症的肿瘤-淋巴结-转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期系统第6版确定肿瘤分期。对于不适合手术治疗的病例,病理诊断和肿瘤分期通过组织活检及影像学检查确定。本研究经过中国医学科学院肿瘤医院伦理会批准,所有研究对象均已签署知情同意书,相关临床资料见表1。

表1 研究对象的临床和人口学特征Tab 1 Clinical and demographic characteristics of subjects

GC: Gastric cancer

1.2 血清标本收集

用血清收集管分别收集5ml胃癌和健康人静脉血,室温静置1h后,用4℃离心机3500r/min离心10min。将上层血清转移到新的收集管后,4℃ 16000r/min离心10min,以除去任何细胞碎片,-80℃保存。

1.3 实时荧光定量PCR检测

采用TRIzol LS试剂(Invitrogen公司,美国)从血清中提取总RNA,具体步骤按照试剂说明书进行,取250μl血清,加入750μl TRIzol LS,室温裂解后分别加入三氯甲烷、异丙醇以及75%乙醇等试剂提取总RNA,溶解于20μl的RNase free ddH2O,用紫外分光光度仪测定总RNA 的吸光度(A260/A280),比值在1.8～2.2的样本经逆转录酶M-MLV(TaKaRa,日本)催化逆转录生成cDNA。逆转录总反应体系为20μl,包含12μl模板RNA、2μl随机引物、1μl dNTP、0.5μl 逆转录酶、0.5μl RNA酶抑制剂以及4μl缓冲溶液,逆转录反应条件为：37℃ 60min,95℃ 5min。反应生成的cDNA模板5倍稀释后采用HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)试剂盒(翊圣生物科技公司,上海)进行实时荧光定量PCR检测。PCR反应体系总体积为20μl,PCR引物由Invitrogen公司合成,CCAT2上游引物：5′-CCCTGGTCAAAT TGCTTAACCT-3′,下游引物：5′-TTATTCGTCCC TCTGTTTTATGGAT-3′;GAPDH上游引物：5′-CC TGGTATGACAACGAATTTG-3′,下游引物：5′-CA GTGAGGGTCTCTCTCTTCC-3′。使用QuantStudioTM7 Flex 实时荧光定量PCR仪(ABI,美国)进行PCR扩增,反应条件为：95℃预变性30s,95℃变性10s,60℃ 退火及延伸30s,40个循环。每个样品设置3个复孔,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。

1.4 肿瘤标志物的检测

采用全自动电化学发光免疫分析仪(罗氏公司,瑞士)通过电化学发光免疫分析法测定血清样本中肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原72-4(CA72-4)和甲胎蛋白(AFP)的表达量,检测结果的上限值分别为5.0ng/ml、39U/ml、8.2U/ml和7.0ng/ml,肿瘤标志物的检测结果通过查阅临床病例资料获得。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 CCAT2在胃癌血清中表达量增高

qRT-PCR检测结果显示,CCAT2在胃癌血清中的表达量为1.730±1.169,而在对照组健康人群血清中的表达量为1.280±0.845,平均增高1.352倍,2组比较差异有统计学意义(P<0.01,图1)。

图1 CCAT2在胃癌和正常对照组血清样本中的差异表达Fig 1 Differential expression of CCAT2 in gastric cancer and controls

The expression of CCAT2 in the serum of 117 cases of gastric cancer (GC) and 100 healthy controls (normal),the results were repeated 3 times,the X-axis was grouped,and the Y-axis data was the logarithm of log2 after the corrected expression of internal reference GAPDH.

2.2 血清CCAT2的表达量与胃癌临床病理特征的相关性

根据胃癌患者的性别、年龄、TNM分期以及病理分化程度等分别进行了对比分析,Mann-Whitney U检验结果显示,血清CCAT2的表达水平与年龄、性别、淋巴结和远处转移以及肿瘤临床分期等均不相关(P>0.05),但其在低分化胃腺癌患者血清中的表达量却明显高于中分化胃腺癌患者(P<0.01,图2)。

2.3 CCAT2的ROC曲线诊断性能

为了评估血清CCAT2对胃癌患者和正常对照组的诊断价值,首先利用SPSS 21统计软件绘制ROC曲线,通过ROC曲线的敏感度和1-特异度值计算出约登指数(Youden’s index),最大约登指数对应的值即为最佳预测值(cut off值)。经计算确定最佳预测值为0.904,此时曲线下面积(AUC)为0.619(95%可信区间为0.544～0.694,P=0.002)(图3)。以0.904为诊断阈值(即危险分数),将样本划分为两组,即高危险风险组和低危险风险组,分别代表胃癌患者和健康人,进行危险分数分析,结果诊断的阳性预测值和阴性预测值分别为66.18%和67.95%。

2.4 血清样本中CEA、CA19-9、CA72-4和AFP的表达量检测

通过查阅病例,对胃癌组和正常对照组样本的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA72-4以及AFP的检测结果进行了统计分析,Mann-Whitney U检验结果显示,胃癌组与对照组血清中AFP的表达量差异无统计学意义(P>0.05),但血清CA19-9(P<0.01)、CEA(P<0.05)和CA72-4(P<0.01)的表达量明显高于对照组,两者相比差异有统计学意义(图4)。

图2 CCAT2表达水平与胃癌临床病理特征的相关性Fig 2 Correlation between CCAT2 expression and clinicopathological characteristics of gastric cancerA-E：The expression level of CCAT2 in gastric cancer serum was not related to sex,age,lymph node metastasis (N),distant metastasis (M), and clinical stage (I to IV) according to the TNM staging;F：The expression level of CCAT2 was negatively correlated with tumor differentiation

图3 CCAT2用于诊断胃癌的ROC曲线Fig 3 The ROC curve of CCAT2 for the diagnosis of gastric cancer

2.5 血清CCAT2诊断标志物与CA19-9、CA72-4和CEA的比较

对血清表达量有显著差异的CA19-9、CA72-4和CEA进行了ROC曲线分析(图5),结果显示,CA19-9、CA72-4和CEA诊断胃癌的曲线下面积分别为0.624(95%可信区间为0.540～0.709)、0.727(95%可信区间为0.651～0.804)和0.604(95%可信区间为0.516～0.691)。三者对胃癌诊断的特异度分别为100%、82.47%和95.92%,但敏感度仅为10.81%、21.21%和17.33%,而同样的病例,CCAT2诊断的特异度和敏感度分别为53.00%和78.63%(表2)。

表2 CCAT2与CA19-9、CA72-4和CEA诊断胃癌的敏感度和特异度比较Tab 2 Comparison of sensitivity and specificity between CCAT2 and CA19-9、 CA72-4 and CEA in the diagnosis of gastric cancer

3 讨论

近年来长链非编码RNAs(lncRNAs)在人类肿瘤发生发展中的作用备受瞩目。最近大量文献报道,CCAT2参与多种人类肿瘤的进程,如CCAT2可以被E2F1激活,并通过与PTTG1相互作用在垂体腺瘤中发挥致癌作用[6]。CCAT2高表达能促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭行为[7];敲低lncRNA CCAT2可通过miR-216b抑制子宫内膜癌细胞的生长和转移[8];CCAT2过表达能明显促进胃癌细胞的增殖和侵袭行为,而CCAT2基因沉默可通过PI3K/mTOR信号通路抑制胃癌细胞的生长增殖,诱导细胞凋亡和自噬[9-11]。作为一种具有致癌作用的lncRNA,CCAT2与多种肿

图4 胃癌组和对照组血清肿瘤标志物的检测结果Fig 4 Detection of serum tumor markers in gastric cancer and control groups

瘤的临床分期、淋巴结转移以及远处转移等相关,不仅是癌症转移及预后评估的新的生物标志物,而且可能成为癌症临床治疗的靶点[12-13]。

本研究通过血清学检测显示,CCAT2在胃癌患者血清中的表达显著高于正常对照组,且CCAT2的表达水平与肿瘤细胞的分化程度呈负相关,病理诊断为低分化的腺癌患者血清CCAT2的表达量显著高于中分化的腺癌患者,这些结果提示血清CCAT2可能成为胃

图5 CA19-9、CEA和CA72-4诊断胃癌的ROC曲线Fig 5 The ROC curve of CA19-9,CEA and CA72-4 in the diagnosis of gastric cancer

癌临床诊断和预后的1个新的检测指标。目前临床常用的胃肠道肿瘤标志物主要有CEA、CA19-9和CA72-4,Liang等[14]通过对2 288例胃癌患者和1 869例健康对照组的分析显示,CEA、CA19-9和CA72-4独立诊断胃癌的敏感度仅为20.1%～27.6%,而三者联合诊断时可将敏感度提高至48.2%。Yu等[15]对216例胃癌患者的CEA、CA19-9和CA7-24的检测结果进行统计分析,三者独立诊断的敏感度分别为22.69%、18.98%和22.69%,而联合诊断的敏感度提高至44.91%,这些统计结果表明,上述3种肿瘤标志物诊断胃癌的敏感度都不高。Guo等[16]对1566例胃癌患者CEA、CA19-9和CA72-4的检测结果进行了ROC曲线分析,结果显示三者的AUC分别为0.582、0.571和0.544。而本研究中CEA、CA19-9和CA72-4诊断胃癌的AUC分别为0.604、0.624和0.727,略高于文献报道,但与本研究中CCAT2诊断胃癌的曲线下面积0.619相近。作为胃癌的诊断标志物,本研究中CEA、CA19-9和CA72-4的诊断特异度高达84.47%～100%,但敏感度差,仅为10.81%～21.21%,作为诊断标志物会导致漏诊率很高,因此不适宜胃癌的大规模筛查和随访。而同样的血清样本,CCAT2诊断胃癌的敏感度达到78.63%,显著高于上述3种肿瘤标志物,故对胃癌的临床诊断具有一定的意义。但是本研究结果显示CCAT2诊断胃癌的特异度不高,仅为53.00%,因此作为独立诊断的标志物效果并不很理想,如果能够与其他诊断标志物如CA72-4等联合诊断,可能会取得更好的诊断效果。

本研究对非编码RNA CCAT2在胃癌血清中的表达进行了检测,并对其诊断效能进行了评估,为非编码RNA进入临床应用提供了实验依据。尽管非编码RNA作为非侵入性生物标志物存在着诸多优点,但由于其作用机制尚未阐明,因此血清CCAT2在胃癌临床诊断方面的价值和意义尚需更深入的研究和大规模的临床样本进行验证。