银杏内脂B抑制NF-κB P65磷酸化对内毒素诱导的小鼠心肌炎损伤的保护作用*

王 瑾 杨东伟 李海洲

(郑州大学附属郑州中心医院,1 心血管内科四病区,2 心内科三病区，郑州 450000)

许多因素都会引发心肌炎,如病毒感染、心脏毒素、药物过敏和风湿病等[1-2]。心肌炎是造成青少年心脏性猝死和扩张型心肌病的主要原因之一,也是导致胸痛、呼吸困难、心悸的重要原因[3-4]。越来越多的研究表明,许多天然产物在心肌炎的治疗中发挥着积极作用[5-6]。银杏叶提取物作为一种治疗与年龄相关的记忆缺陷的中药已具有数百年的历史,近年来发现银杏叶提取物在抗炎、抗癌及抗氧化等方面发挥着重要作用[7]。银杏内脂B是银杏叶的主要活性物质之一,属于二萜类物质。大量数据表明银杏内脂B有利于缺血性中风、糖尿病内皮功能紊乱和脊髓损伤等疾病的治疗[8-10]。本研究旨在探索银杏内脂B对内毒素 (endotoxin,Ex) 诱导的心肌损伤、细胞凋亡及炎症反应的影响及分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验药物和主要试剂

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)来源于Sigma公司,货号与规格为L3012-25mg;银杏内脂B来源于Sigma-Aldrich,HPLC≥90%,货号与规格为G6910-50mg。

苏木精伊红(hematoxylin-eosin,H-E)染色液(G1120)购自北京索莱宝有限公司。心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin,cTnⅠ)ELISA检测试剂盒(69-57623)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH) ELISA检测试剂盒(MSK,59-20039)。肌红蛋白(myoglobin,Mb) ELISA检测试剂盒(69-20199)。肌酸激酶同工酶(creatine phosphokinase isoenzyme,CK-MB)ELISA检测试剂盒(69-79625)。ELISA白细胞介素(interleukin)-6 ELISA检测试剂盒(69-99854)。IL-1β的ELISA检测试剂盒(MSK,69-59812)购自默沙克生物科技有限公司。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)ELISA检测试剂盒(Beyotime,PT512)购自碧云天生物有限公司。抗caspase-3(ab13847)抗体、抗Bcl-2(ab59348)抗体、。抗Bax(ab216494)抗体、抗NF-κB P65(ab207297)抗体、抗p-NF-κB P65(ab222494)抗体购自Abcam公司。

1.2 动物及分租

24只C57BL/10小鼠由中国科学院实验动物中心提供。小鼠随机分为4组：对照组(Ctrl)、银杏内脂B(GB)组、内毒素(Ex)组、内毒素+银杏内脂B(Ex+GB)组。首先内毒素组和内毒素+银杏内脂B组一次性腹腔注射LPS (10mg/kg),对照组和银杏内脂B组用生理盐水代替LPS。然后银杏内脂B组和内毒素+银杏内脂B组每天进行腹腔注银杏内脂B(100mg·kg-1·d-1),连续注射9d。对照组和内毒素组用生理盐水代替银杏内脂B进行注射。

1.3 H-E染色检测各组小鼠心肌组织病变情况

颈椎脱臼法处死小鼠后取左心室心肌组织用4%的多聚甲醛在4℃下固定24h。PBS清洗3次,再用30%、50%和70%的乙醇依次脱水10min。去除乙醇脱水机中脱水,经石蜡包埋后进行切片。按照H-E染色液说明书进行H-E染色。光镜下观察心肌组织病变情况。

1.4 ELISA检测心肌损伤因子水平

收集各组小鼠血清,按照ELISA试剂盒说明书进行检测。首先样品加入反应孔后37℃孵育30min,洗涤后加入酶标试剂37℃反应30min。再加显色试剂37℃避光显色15min。加终止液终止反应后450nm处检测各个反应孔测吸光值。

1.5 免疫印迹检测心肌损伤因子的蛋白表达

向待测组织细胞加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取,100℃变性5min后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜。5%的BSA封闭1h后加入相应的一抗,4℃过夜孵育。第2天加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1.5h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.6 统计学处理

以SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析,两两比较用独立的t检验。

2 结果

2.1 银杏内脂B可改善内毒素诱导的心肌炎小鼠心肌组织病变

H-E染色观察银杏内脂B对内毒素诱导的心肌炎小鼠心肌组织病变的影响。结果显示(图1),对照组和银杏内脂B组细胞形态正常,胞质均匀,排列整理有序,无断裂;内毒素组细胞肿胀,细胞核增大,排列紊乱,横纹不清。内毒素+银杏内脂B组细胞形态恢复正常,排列规则,无断裂。由此可见,银杏内脂B可减轻内毒素诱导的心肌炎小鼠心肌组织病变。

图1 H-E染色观察心肌组织病变,×200Fig 1 The pathological changes of myocardial tissues were observed by H-E staining,×200A: Ctrl group;B: GB group;C: Ex group;D: Ex+GB group

2.2 银杏内脂B可抑制内毒素诱导的心肌炎小鼠心肌损伤标记蛋白的升高

通过ELISA检测心肌损伤标记蛋白cTnⅠ、 Mb、CK-MB和LDH蛋白水平,分析银杏内脂B对内毒素诱导的心肌炎小鼠心肌损伤的影响。结果(图2)显示,内毒素组cTnⅠ、 Mb、CK-MB和LDH水平明显高于对照组(P<0.05)。与内毒素组相比,内毒素+银杏内脂B组cTnⅠ、 Mb、 CK-MB和LDH水平明显降低(P<0.05)。上述结果表明,银杏内脂B可抑制内毒素诱导的心肌炎小鼠心肌损伤标记蛋白cTnⅠ、 Mb、 CK-MB和LDH水平的升高,减弱心肌损伤。

2.3 银杏内脂B对内毒素诱导的心肌炎小鼠细胞凋亡相关蛋白表达的影响

为分析银杏内脂B对内毒素诱导的心肌炎小鼠细胞凋亡的影响,免疫印迹检测细胞凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。结果(图3)显示,内毒

图2 ELISA检测心肌损伤标记物蛋白水平Fig 2 The protein levels of myocardial injury marker were tested by ELISA*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs experimental group

素组caspase-3和Bax表达明显高于对照组,Bcl-2表达明显低于对照组(P<0.05)。与内毒素组相比,内毒素+银杏内脂B组caspase-3和Bax表达明显降低,Bcl-2表达明显升高(P<0.05)。由此可见,银杏内脂B可抑制内毒素诱导的心肌炎小鼠caspase-3和Bax表达的上升和Bcl-2表达的下降,降低细胞凋亡。

图3 免疫印迹检测细胞凋亡相关蛋白表达Fig 3 The expression of apoptosis related peoteins were detected by Western blotting*P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs experimental group

2.4 银杏内脂B可减弱内毒素诱导的心肌炎小鼠炎症反应的增强

利用ELISA检测促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,分析银杏内脂B对内毒素诱导的心肌炎小鼠炎症反应的影响。结果显示(图4),内毒素组TNF-α、IL-6 和IL-1β水平明显高于对照组(P<0.05)。银杏内脂B可抑制内毒素诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β水平的升高(P<0.05)。以上结果说明,银杏内脂B可减弱内毒素诱导的心肌炎小鼠炎症反应的增强。

图4 ELISA检测炎症因子Fig 4 The levels of inflammatory factors were measured by ELISA*P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs experimental group

2.5 银杏内脂B可抑制内毒素诱导的心肌炎小鼠NF-κB P65磷酸化的上升

为进一步探究银杏内脂B影响内毒素诱导的心肌炎小鼠的分子机制,免疫印迹检测NF-κB P65和p-NF-κB P65蛋白水平。结果显示(图5),NF-κB P65蛋白水平无明显变化,内毒素组p-NF-κB P65蛋白水平最高。内毒素组p-P65/P65比值明显高于对照组(P<0.05)。内毒素+银杏内脂B组p-P65/P65比值明显低于内毒素组(P<0.05)。上述结果表明,银杏内脂B可抑制内毒素诱导的心肌炎小鼠NF-κB P65磷酸化的上升。

3 讨论

目前对心肌炎的治疗方法分为药物疗法、免疫调节、免疫抑制及抗病毒治疗等。药物疗法是心肌炎的主要治疗手段,所用药物包括血管紧张素转换酶抑制剂,醛固酮拮抗剂及卡维地洛等[11]。许多天然产物由于具有抗病毒、抗炎及抗癌等生物活性而受到越来越

图5 免疫印迹检测NF-κB P65磷酸化水平Fig 5 The phosphorylation levels of NF-κB P65 were tested by Western blotting*P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs experimental group

多的关注[12-14]。大量文献报道各种各样的天然产物具有减轻心肌组织病变的功效。Lim等[15]报道尾叶香茶菜提取物OR12可改善柯萨奇B3病毒诱导的小鼠心肌组织损伤。有数据表明小檗碱可减轻自身免疫性心肌炎大鼠心肌纤维紊乱等心肌炎病变[16]。另外,长蒴黄麻叶提取物可改善三氧化二砷诱导的心肌炎大鼠心肌组织损伤[17]。本研究结果显示,银杏内脂B可改善内毒素诱导的心肌细胞肿胀,细胞核增大,排列紊乱等,这些结果表明银杏内脂B可减轻内毒素诱导的心肌炎小鼠心肌组织病变。

研究表明许多天然产物可以逆转各种疾病中心肌损伤标记物水平的变化。据报道红景天苷可降低LPS诱导的心肌炎大鼠CK-MB和LDH的释放[18]。Gui等[19]报道黄芪甲苷Ⅳ可抑制CK-MB和cTnⅠ水平的升高。有数据显示银杏内脂B可减弱缺血再灌注大鼠LDH水平的升高[20-21]。本研究结果表明,在内毒素诱导的心肌炎小鼠中,银杏内脂B可抑制cTnⅠ、 Mb、CK-MB和LDH水平的升高,减轻心肌损伤。

大量研究表明天然产物在调节细胞凋亡方面发挥着积极作用。Mito等[22]报道姜黄素可降低急性心肌炎大鼠细胞凋亡的增加,抑制caspase-3和caspase-7表达的增强。据报道银杏内脂B具有降低高海拔导致的脑水肿大鼠caspase-3表达上升的功能[23]。在急性脊髓损伤大鼠中,银杏内脂B可提高Bcl-2/Bax相对表达量比值,抑制caspase-3表达的增强[24]。此外,银杏内脂B还可减弱阿霉素诱导的心脏毒性小鼠caspase-3和Bax表达的增强和Bcl-2表达的下降[25]。本研究结果显示,银杏内脂B可抑制内毒素诱导的心肌炎小鼠caspase-3和Bax表达的上升和Bcl-2表达的下降,减弱细胞凋亡。

炎症反应的增强是多种疾病的常见病症。很多天然产物都具有抗炎的作用。据报道芹黄素可抑制自身免疫性心肌炎小鼠促炎因子INF-γ、 TNF-α和IL-2水平的升高[26]。在柯萨奇B3病毒诱导的心肌炎小鼠中,三七总皂苷可降低TNF-α和IL-6水平的上升[27]。有数据显示,银杏内脂B可减弱碱烧伤诱导的小鼠角膜IL-6和IL-1β的表达的增强[28]。本研究结果表明,银杏内脂B可抑制内毒素诱导的心肌炎小鼠TNF-α、IL-6 和IL-1β水平的升高,降低炎症反应。

NF-κB通路在各种细胞进程中起着重要作用,许多天然产物都可以影响NF-κB通路活化。据报道姜黄素可通过抑制NF-κB通路减轻柯萨奇B3病毒诱导的小鼠心肌炎损伤[29]。Zempo等[30]报道可可多酚可减弱自身免疫性心肌炎小鼠NF-κB P65磷酸化水平的升高。银杏内脂B可通过抑制NF-κB P65磷酸化水平的上升减轻LPS诱导的炎症反应[31]。本研究结果显示,银杏内脂B可通过抑制NF-κB P65磷酸化减轻内毒素诱导的小鼠心肌炎损伤，为心肌炎的治疗提供了理论依据。