黑曲霉ZD利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶条件优化

郭凯，崔卫东，王宁，侯敏，包慧芳，房世杰

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院科研管理处，乌鲁木齐 830091；3.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】新疆地区棉花种植面积占据我国的大半，且产量颇丰，由此也产生大量棉花秸秆浪费现象[1]。目前对于棉花秸秆处理采取当地焚烧和还田处理，对于当地土壤理化性质和微生物菌群造成严重破坏，因此，对于棉花秸秆这种可再生资源的利用，不仅可以解决环境破坏和资源浪费问题，还可以增加农民收入[2]。通过对棉花秸秆营养成分的测定，发现棉花秸秆的粗蛋白含量比小麦、水稻和玉米秸秆要高[3]。黑曲霉是公认的安全菌株，生长速度快，营养要求低，且产生的纤维素酶，酶系全面，是较合适利用棉花秸秆作为发酵基质的生产菌株[4]。【前人研究进展】固体发酵与液体发酵相比，具备了发酵培养基原料来源广泛，环境污染少，不需要严格的无菌条件，投资少，易操作的优点。固体发酵产纤维素酶的研究有很多，在菌种选择和发酵基质上种类也很多。伍红等[5]利用甘蔗渣和麸皮作为发酵基质，对黑曲霉固态发酵产纤维素酶活进行优化。张宁等[6]选择麸皮和玉米秸秆作为发酵基质，通过麸皮和玉米秸秆的配比，料液比，发酵时间，发酵温度和发酵起始pH对发酵产酶的影响，对里氏木霉固体发酵产纤维素酶进行优化。【本研究切入点】利用可再生资源棉花秸秆作为发酵基质，运用高产纤维素酶菌株黑曲霉进行固体发酵，优化发酵条件，提高纤维素酶活。【拟解决的关键问题】通过对棉花秸秆和玉米粉的质量比、发酵时间、接种量、加水量和不同pH值的单因素试验，再通过PB试验设计筛选出主要因素，通过爬坡试验设计中心点，最后借助响应面对发酵条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌种

黑曲霉ZD，由新疆农业科学院微生物应用研究所分离，现保存于新疆农业科学院微生物应用研究所菌保室。

1.1.2 样品

五家渠种植棉花采摘后产生的棉花秸秆，经粉碎机粉碎后过40目筛。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂15～20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。马铃薯去皮，切成块煮沸0.5 h，然后用纱布过滤，再加糖，融化后补足水至1 000 mL。121℃、30 min灭菌(液体培养基不用加琼脂)。

斜面培养基：PDA培养基。

种子培养基：PDA液体培养基[7]。产酶初始液体培养基：可溶性淀粉 1 g/100 mL，蛋白胨0.5 g/100 mL，硫酸镁0.05 g/100 mL，磷酸氢二钾0.1 g/100 mL。

初始固体发酵培养基：棉花秸秆20 g，玉米粉10 g，硫酸铵5 g，加水量50%，搅拌混匀后，装入500 mL三角瓶，121℃灭菌30 min，然后接入5%菌液。

1.2 方 法

1.2.1 固体发酵粗酶液制备

从三角瓶中取出10 g(接入5%菌液，已经发酵7 d的培养物作为对照)发酵培养物，加10倍于酶曲质量的无菌水，30℃,150 r/min摇床震荡浸提1 h，使酶蛋白充分释然，然后用八层纱布过滤，取滤液于4℃、8 000 r/min下离心10 min，上清即为粗酶液[8-9]。

1.2.2 酶活检测

以羧甲基纤维素钠酶活为测定指标，取4支25 mL刻度试管，其中3支加入2 mL羧甲基纤维素钠溶液和0.5 mL粗酶液，然后50 ℃水浴加热30 min。另外1支先加入0.5 mL粗酶液，沸水浴5 min，使酶完全失活，再加入2 mL羧甲基纤维素钠溶液作为对照。将4支试管同时加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，用蒸馏水定容至25 mL，再用紫外分光光度计在540 nm下测吸光值(A540)。酶活力计算以每1 min产生1 μmol还原糖定义为1个酶活力单位(U)[10-11]。

1.2.3 标准曲线制备

葡萄糖标准液制备：称取无水葡萄糖1 g(精确至0.001 g)加柠檬酸盐缓冲液定容至100 mL。

量取标准葡萄糖溶液0、2、4、6、8、10 mL，用柠檬酸盐缓冲液定容至50 mL,配成浓度为0～2 mg/mL的标准系列。

分别吸取葡萄糖标准系列溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，各加2 mL水和3 mL DNS溶液沸水浴5 min，冷却至室温，用水定容至25 mL，在540 nm波长下测吸光值(OD值)，并用葡萄糖含量(mg)与测定值(OD)作图，即为标准曲线。Y=0.009 8x-0.013 8(R2=0.998 7)。

式中：Y为相当葡萄糖含量/(mg/mL)；x为酶解反应产物溶液经显色后所测的OD540nm值。说明在葡萄糖质量浓度范围内线性关系较好[12-13]。

1.2.4 单因素试验设计

分别对棉花秸秆与玉米粉的质量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)，发酵时间(7、15、20、30、40 d)，接种量(5%、10%、15%)，加水量(50%、55%、60%、65%)和pH值(3、4、5、6、7)进行单因素试验。每个处理3个重复，在基础固体发酵培养基下调节各个参数，确定每个影响因素的最适条件。

1.2.5 Plackett-Burman(PB)设计

分别选取以上5个因素的高低2个水平，通过Design-Expert软件选用Factors=5，Runs=12的PB设计，以羧甲基纤维素酶(CMCase)活力响应值。通过比较各因素的显著性水平，筛选出对酶活力影响较为显著的因素。

1.2.6 最陡爬坡试验

根据PB试验及其分析结果设计最陡爬坡试验，即对显著因素进行梯度设计，根据显著因素一次项的系数，正系数逐渐递增确定变化范围；负系数逐渐递减确定变化范围，以此来确定中心点。其余不显著的因素根据PB分析模型中系数的正负进行选取，正系数取高水平，负系数选取低水平。

1.2.7 Box-Behnken中心组合设计

逼近最大酶活区后，进行Box-Behnken中心组合试验设计，以试验结果拟合建立描述响应量(酶活)与自变量(影响酶活的显著性因素)关系的多项式回归模型。

1.2.8 统计分析

所有试验每个处理做4个重复，用Origin软件做数据误差分析，Design-Expert对PB试验和中心组和设计进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

研究表明，在棉花秸秆和玉米粉的质量比为4∶1，发酵时间为40 d，接种量为10%，含水量为60%，pH值为4时，黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵的产酶能力最优，因此，对筛选出来的水平进行PB设计。图1

图1 各因素下黑曲霉固体发酵产酶变化
Fig.1 Effects of various factors on the production of enzymes by Aspergillus niger solid fermentation

2.2 PB试验设计和优化

根据前期试验结果，设计Plackett-Burman试验来筛选影响黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产酶的主要因素，每组试验设4个重复(结果均为4个结果的平均值)。PB试验设计及结果见表1和表2，统计分析结果见表3。由表3的方差统计分析，模型的P值为0.037 1<0.05，模型选择正确。由变量显著性P值大小可知，棉花秸秆与玉米粉的质量比(P=0.039 4)，接种量(P=0.043 4)，含水量(0.015 9)P值均小于0.05，说明棉花秸秆与玉米粉的质量比，接种量和含水量对黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产酶影响显著，且含水量>碳氮比﹥接种量。其他因素对黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产酶影响不显著，因此，选取碳氮比，接种量和含水量进一步优化。表1～3

表1 Plackett-Burman试验因素水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

因素Factor水平 Level-11棉秆与玉米粉质量比Mass ratio of cotton stalk to corn flour(X1)4∶15∶1发酵时间Fermentation time(X2)40 d50 d接种量Inoculation rate(X3)10%12.5%含水量Water content(X4)60%65%pH值pH value(X5)34

表2 PB试验设计及其结果
Table 2 Experimental design and responses of Plackett-Burman design

试验号Test number棉秆与玉米粉质量比Mass ratio of cotton stalk to corn flour发酵时间Fermentation time接种量Inoculation rate含水量Water contentpH值pH value酶活(U/mL)Enzyme activity1-1111-1254.334211-111258.9303-1-1-11-1262.3454111-1-1298.3205-111-11286.2206-11-111250.339711-1-1-1270.5548-1-11-11273.2209-1-1-1-1-1266.201101-111-1277.234111-1-1-11285.364121-1111279.242

表3 PB试验方差
Table 3 ANOVA analysis for PB experimentation

来源Source平方和Sum of square自由度df均方Mean squareF值F valueP值p-value模型 Model1 804.4555360.8915.033 8430.037 1X1-棉秆与玉米粉质量比 Mass ratio of cotton stalk to corn flour493.185 41493.185 46.879 1340.039 4X2-发酵时间 Fermentation time51.551 37151.551 370.719 0580.429 0X3-接种量 inoculation rate466.627 41466.627 46.508 6930.043 4X4-含水量 Water content791.570 11791.570 111.041 120.015 9X5-pH值 pH value1.520 83211.520 8320.021 2130.889 0残差 Residual430.157 7671.692 95总值 Total2 234.61311

2.3 最陡爬坡试验

根据PB试验结果设计最陡爬坡试验设计路径，其步长和爬坡方向，可以根据PB试验中影响因素系数正负来决定，按0.5的步长增加棉秆与玉米粉的比例，按1%的步长增加接种量，按2.5%的步长减少含水量。其余因素均取单因素试验的结果。检测固体发酵酶活的变化，每组做4个重复(表中结果为平均值)。当棉秆与玉米粉质量比为4∶1，接种量为10%，含水量为60%时，黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产酶的酶活最高，因此，选择第一组作为中心点，进行下一步优化试验。表4

表4 最陡爬坡试验及结果
Table 4 Steepest ascent path design and result

试验号Test number棉秆与玉米粉质量比X1 Mass ratio of cotton stalk to corn flour接种量X3 inoculation rate含水量X4 Water contentCMC酶活(U/mL)Enzyme activity14∶110%60%299.12924.5∶111%57.5%295.39835∶112%55%284.39045.5∶113%53.5%290.33056∶114%50%294.204

2.4 Box-Behnken中心组合设计

采用Box-Behnken法进行中心组合试验设计，非显著因素采用单因素试验结果，以固体发酵的CMC酶活为响应值，采用Facotors=3，Runs=17的中心组合设计，每组试验做4个重复(表中结果为平均值)。Box-Behnken中心组合试验设计和结果见表5和表6。通过中心组合试验设计，对数据进行二次多元回归拟合，得到二次多项式方程：

Y=304.867 60+0.547 88X1+2.088 38X3+3.361 00X4-6.612 50X1X3+3.750 75X1X4-6.957 75X3X4-11.826 55X12-4.149 05X32-5.470 80X42。表5，表6

表5 中心组和试验设计因素水平Table5Centergroupandexperimentaldesignfactorlevel

因素Factor水平 Level-101棉秆与玉米粉质量比X1Mass ratio of cotton stalk to corn flour 3∶14∶15∶1接种量X2Inoculation rate8%10%12%含水量X3Water conten55%60%65%

表6 中心组和设计方案及结果
Table 6 Central composite design and results

试验号Test number因素 Factor棉秆与玉米粉的比例Mass ratio of cotton stalk to corn flour 接种量Inoculation rate含水量Water contenCMC酶活(U/mL)Enzyme activity1000307.4592-10-1288.3083101294.3344-110296.7805-1-10280.3386000305.2097110284.22181-10294.2299000306.90210-101285.30711011295.330120-1-1281.2501310-1282.3321401-1300.30215000303.564160-11304.10917000301.204

研究表明，模型的P值为0.000 1远小于0.01，极显著，说明方程拟合度较好；失拟项反应的是模型与试验数据的相符情况，P值越大，说明模型与试验数据越相符合，失拟项的P值=0.639 4﹥0.05，影响不显著，模型选择正确。从表中可以看出，X1X3的P值=0.000 8，X1X4的P值=0.014 8，X3X4的P值=0.000 6，碳氮比和接种量的交互作用极显著，接种量和含水量之间交互作用极显著，碳氮比和接种量交互作用为显著，说明每个因素之间互相影响，共同促进黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产酶。表7

研究表明，复相关系数R2=0.973 6，说明模型可以解释97.36%试验所得酶活力变化，预测值和实际值之间具有较高的相关性；校正后的R2=0.939 7，说明模型可信度较高，能够很好表明试验结果；Y的变异系数CV=0.79，数值较低，说明试验精确度较高，操作可信。信噪比=14.084，数值较大，说明试验数据有效值远远大于无效值。表8

表7 回归方程方差
Table 7 ANOVA analysis for regression equation

方差来源Source平方和Sum of square自由度df均方Mean squareF值F valueP值P value模型Model1 408.759156.5328.70.000 1X1-棉秆与玉米粉质量比Mass ratio of cotton stalk to corn flour2.412.40.440.528 2X3-接种量inoculation rate34.89134.896.40.039 3X4-含水量Water conten90.37190.3716.570.004 7X1X3174.91174.932.070.000 8X1X456.27156.2710.320.014 8X3X4193.641193.6435.510.000 6X12588.911588.91107.99< 0.000 1X3272.48172.4813.290.008 2X42126.021126.0223.110.002残差 Residual38.1775.45失拟项 Lack of Fit12.0834.030.620.639 4纯误差 Pure Error 26.0946.52总值 Total1 446.9216

表8 模型可信度
Table 8 Fit statistics for Y

标准差 Std.Dev2.34复相关关系数 R2R-Squared0.973 6均值 Mean294.78校正后的R2 Adj R-Squared0.939 7Y的变异系数C.V.(%)0.79预测复相关系数R2 Pred R-Squaerd0.838 2预测误差平方和 Press Sum of square234.08信噪比 Adeq Precisior14.084

2.5 验证试验

利用Design-Expert软件对回归模型画出各个因素对黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产酶交互作用的等高线图和响应面。等高线图反映因素间的交互作用，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。研究三张等高线图均为椭圆形代表相互作用显著，碳氮比和接种量对固体发酵产酶交互作用显著；碳氮比和含水量对固体发酵产酶交互作用显著；接种量和含水量对固体发酵产酶交互作用显著。再由图和软件对方程式进行分析和优化，确定最优试验点编码X1,X3,X4(0.44,-0.94,1.00),即棉花秸秆与玉米粉的质量比为4.4∶1，接种量为8.12%，含水量为65%。此条件下该模型预测黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产酶的酶活为306.006 U/mL。

由于以上最佳条件未在验证的17组试验中，需要进一步验证。在优化后的培养条件下，即棉花秸秆和玉米粉的质量比为4.4∶1，接种量为8.12%，含水量为65%，发酵时间40 d，pH值为4，然后测定CMC酶活，共做了4个重复，将未优化发酵条件(棉花秸秆和玉米粉的质量比为4∶1，发酵时间20 d，接种量5%，含水量50%，pH值为7)的试验结果作为对照，同样做了4个重复，平均值为207.496 U/mL。在预测的最优条件下，测得CMC酶活为310.885 U/mL(4次所测平均值)，与预测值比较接近，且比未优化的发酵条件下酶活提高了49.8%。图2～4

图2 碳氮比和接种量对CMC酶活交互作用的等高线图和响应面
Fig.2 Response surface plot and contour plot for the interaction effect of Ratio of carbon

andnitrogenandinoculumamountonenzymeactivityofCMC

图3 碳氮比和含水量对CMC酶活交互作用的等高线图和响应面
Fig.3 Response surface plot and contour plot for the interaction effect of Ratio of carbon and nitrogen and water content on enzyme activity of CMC

图4 接种量和含水量对CMC酶活交互作用的等高线图和响应面
Fig.4 Response surface plot and contour plot for the interaction effect of inoculum amount and water content on enzyme activity of CMC

3 讨 论

3.1 固体发酵产纤维素酶菌种选择很重要，要求菌种易生长繁殖，能够可以很好地利用废弃物作为生长繁殖及产酶的基质。研究以黑曲霉为发酵菌株，黑曲霉为曲酶属真菌常见菌种，高产纤维素酶菌种之一，且产纤维素酶酶系全面，是重要的发酵工业菌种，且黑曲霉具有裂解大分子有机物的能力，因此，选取黑曲霉发酵棉花秸秆，是很好的研究方向。宋晓妍等[14]利用玉米秸秆和麸皮，以高产纤维素酶绿色木霉为发酵菌株，羧甲基纤维素钠酶活力达到72.5 U/g；吴发远[15]研究了康氏木霉利用稻草和麸皮进行固体发酵，所产纤维素酶：羧甲基纤维素钠酶活为321.64 U/mL，滤纸分解酶活力为59.58 U/mL；林蒙蒙等[16]利用白腐真菌进行固体发酵产纤维素酶，羧甲基纤维素钠酶活达到27.15 U/g，和滤纸分解酶活力为3.16 U/g。

3.2 除了菌种选择，固体发酵条件像发酵时间、发酵基质和辅料的配比、接种量、含水量、pH值和辅料对固体发酵产酶有着比较大的影响。固体发酵过程中发酵基质和辅料配比非常重要，合适的比例有利于固体发酵产酶，过高或过低有可能产生对于菌种生长不利的物质，抑制微生物生长繁殖产酶；也有可能产生氨气，损失大量氮源影响微生物代谢，导致产酶降低。含水量的多少也非常重要，调节合适基质含水量可以给微生物生长提供良好的气体交换、热传递和营养供应，过低或过高的水分都会影响微生物的正常生长进而降低产酶量。接种量对固体发酵影响也很重要，采用较大的接种量可以缩短菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济，过小会延长培养时间。靖德兵等[17]应用双温度培养法进行康氏木霉固体发酵生产纤维素酶，在自然补给氧气，发酵培养基以50%稻草粉，8%(NH4)2SO4，42%麸皮，加固体物质的4.9倍的水，再配以少量吐温80，保持环境湿度约60%，发酵72 h，提高了纤维素酶活力。袁丽环[18]以玉米秸秆为原料，利用菌株固体发酵生产纤维素酶，确定固体发酵生产纤维素酶的最佳工艺参数：8%接种量，30℃温度下66 h，酶活达到142.55 U/mL。张辉等[19]研究嗜热侧孢霉固体发酵产纤维素酶，在最适合产酶条件下：麸皮∶甘蔗渣(1∶2)50 g，(NH4)2SO41 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.03 g，60%含水量，pH 5.5，培养温度45℃，测得羧甲基纤维素钠酶活320.04 U/mL，滤纸分解酶活力38.65 U/mL，棉花酶活力180.31 U/mL。

4 结 论

4.1 通过单因素试验，对影响黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶的5种发酵条件的显著性进行了研究，再利用Plackett-Burman试验设计，经方差分析，确定影响黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵的主要因素碳氮比，接种量和含水率，得出显著性顺序为含水率﹥棉花秸秆与玉米粉的质量比﹥接种量。

4.2 通过最陡爬坡试验，根据PB试验设计结果，设计步长和爬坡方向，确定棉花秸秆和玉米粉的质量比4∶1，接种量10%和含水率60%为中心点；再利用Box-Behnken试验设计的方法，以爬坡试验的结果为中心点，通过响应面优化确定了黑曲霉利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶的最佳发酵条件：棉花秸秆与玉米粉的质量比为4.4∶1，接种量8.12%，含水率65%，发酵时间40 d和pH值4。固体发酵酶活达到310.885 U/mL，比未优化条件下的酶活207.496提高了49.8%。