库尔勒香梨PsiERF基因的克隆和表达分析

徐航，全绍文，马丽，周丽，牛建新

(石河子大学农学院园艺系/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】库尔勒香梨(Pyrus×sinkiangensisT.T.Yu)，属蔷薇科，是新疆梨的一个古老栽培品种。库尔勒香梨果实具有果香浓郁，口感细腻，石细胞少且耐贮藏等特点[1]。由于遗传因素的影响，库尔勒香梨存在严重的萼片宿存现象，极大的影响了香梨的外观及品质。AP2/ERF是一个庞大的转录因子基因家族，含有由60～70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域，存在于所有的植物当中[2]。AP2/ERF超家族中的基因已经在119～200种植物中被发现并进行了研究[3-6]。这个家族中的成员参与多种生物学过程，包括植物生长、花发育[7-8]、果实发育[9]、种子发育[10]、衰老[11]、病菌防御[12]、非生物逆境胁迫响应[13]。另外，AP2/ERF类转录因子参与水杨酸、茉莉酸[14]、乙烯[15-18]、脱落酸[19]等多种信号转导途径，而且某些家族成员是逆境信号交叉途径中的连接因子。根据其序列相似性和AP2/ERF结构域的数量，将其分为四类，分别是AP2、ERF、和RAV家族和其他[20]。其中ERF家族包含1个AP2/ERF结构域，可以分为2个大的亚家族，CBF/DREB亚家族和ERF亚家族[21]。研究表明，低温和脱落酸都对库尔勒香梨的萼片脱落宿存产生影响，这与ERF转录因子所调节的功能相吻合。因此，研究PsiERF转录因子的表达量对库尔勒香梨萼片脱落与宿存的关系具有重要意义。【前人研究进展】前人的研究主要集中在栽培措施、生长势、授粉品种[22-23]、生长调节剂[24-26]和矿质元素[27]等生理层面。近些年来，对于这一问题的分子机制研究逐渐增多，其中有学者通过差异显示PCR技术克隆了库尔勒香梨中控制开花和激素调节相关的kfpMYB基因[28-30]，Qi等[31]通过数字转录丰度的方法筛选了一些与光合作用、植物激素信号传导、细胞壁修饰、转录调控和碳水化合物代谢等有关的可能影响库尔勒香梨萼片脱落的基因，孙晓霞等[32]采用Illumina高通量测序技术发现了3条与萼片发育相关的Unigenes，田嘉等[33]分离和克隆了库尔勒香梨果胶裂解酶PsPL。裴茂松等[34]对库尔勒香梨中的NAC基因做了克隆及表达分析。【本研究切入点】基于实验室前人的研究基础，利用库尔勒香梨花器官转录组拼接的Unigenes，获得一个完整的ERF基因cDNA序列，并对该基因进行了序列和结构分析。【拟解决的关键问题】利用实时荧光定量PCR检测了其在花期不同时期、不同器官，脱萼样品和宿萼样品的表达情况，对照前人对ERF转录因子的研究，研究Psi ERF转录因子对库尔勒香梨萼片宿存与脱落的关系，为研究库尔勒香梨萼片宿存和脱落分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

样品于4月取自新疆库尔勒市沙依东园艺场，分别选取强势树与弱势树各3株作为试验树，于初花期、盛花期、末花期采集强势树上的第1序位(宿萼)和弱势树第4序位(脱萼)的全花各50朵，去除花瓣，分离子房和萼片，分别将两部分用锡箔纸保存，投入液氮处理，后置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 生物信息学分析

利用NCBI BLAST进行核酸以及氨基酸序列的同源性比对，DNAMAN对核酸的序列进行编辑和分析，OFR Finder查找开放阅读框，ExPASy-ProtParam toll和SignalP分析氨基酸序列的基本结构，氨基酸的亲水性、等电点、信号肽等信息，PRABI Lyon Gerland 预测氨基酸序列的二级结构。DNAMAN和MEGA7.0分析同源性及构建系统发育树。

1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成

利用TIANGEN公司柱式植物RNAout1.0试剂盒提取库尔勒香梨花样品的总RNA，用NANODrop2000监测RNA的浓度和纯度(OD260/280比值)，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。利用Takara的M-MLV反转录酶和反转录引物B26(5'-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')合成单链cDNA。

1.2.3 实时荧光定量PCR引物的筛选

对强势树第1序位全花(宿萼)和弱势树第4序位全花(脱萼)进行转录组测序共得到103个差异表达基因；对强势树第1序位萼片和弱势树第4序位萼片进行数字表达谱测序共得到64个差异表达基因；对强势树第1序位子房和弱势树第4序位子房进行数字表达谱测序共得到95个差异表达基因。比较转录组和表达谱的测序结果，得到二者共有差异表达基因10个，分别是植物生长素诱导蛋白5NG4(comp50752_c0)、聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIG(comp49798_c0)、β-半乳糖甘酶(comp49925_c0)、β-1，3-葡聚糖酶(comp43208_c0)、脱水响应蛋白(comp44869_c0)、脱水反应结合元件蛋白(comp49899_c0)、脂转移蛋白前体(comp36582_c0)、NAC结构域蛋白NAC002(comp41728_c0)和乙烯响应转录因子ERF109(comp36863_c0)、ERF027(comp44254_c0)基因。从库尔勒香梨转录组测序数据中调出拼接的ERF109即PsiERF的Unigene，提交到NCBI数据库进行比对，该Unigene与白梨的(Pyrus ×bretschneideri)全长cDNA序列(LOC103946790)高度同源，根据其保守区用Primer Premier5.0软件设计引物，序列为ERFP1:5'-AACTACTTCTCGCCATCGT-3'和ERFP2: 5'-TGTTCTTGCTCTTCCTCGT-3'。

以cDNA为模版，用PsiERF的特异引物ERFP1/ERFP2进行PCR。反应体系为：2×TaqMix 12.5 μL，cDNA(模版)2 μL，引物ERFP1和ERFP2(μmol/L)各1 μL，其余用无菌水补足至25 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，30各循环后72℃再延伸10 min。PCR产物分别进行回收纯化后连接到pEASY-T1，转化至DH5α，进行蓝白斑筛选和菌液PCR鉴定，将阳性克隆进行测序，对测序结果进行比对和分析。

1.2.4 实时荧光定量PCR

用天恩泽公司的柱式植物RNAout 1.0分别提取初花期、盛花期、末花期3个时期强势树上第1序位的全花、萼片、子房和弱势树上第4序位的全花、萼片、子房的总RNA(用Thermo Scientific DNase Ⅰ去除DNA污染)，并对每个样品设置3个生物学重复。利用Takara的M-MLV反转录酶合成cDNA，用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(东洋坊，上海)进行实时荧光定量PCR，PCR程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，54℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环，溶解曲线的温度是65～95℃。所用的内参引物为Actin(上游引物：5'- CCATCCAGGCTGTTCTCTC-3'，下游引物：5'-GCAAGGTCCAGACGAAGG-3')，基因的相对表达量分析用2-△△CT法:ΔΔCt= (CT，Target-CT，Actin)Time x-(CT，Target-CT，Actin)Time 0。

2 结果与分析

2.1 序列分析

基于库尔勒香梨转录组测序结果(库尔勒香梨萼片脱落组和宿存组花的转录组测序数据，已经上传到NCBI SRA 数据库，登录号：PRJNA303067，(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/303067))采用TMM(测试成熟度模型)对read count数据进行标准化处理，再用DEGseq进行差异分析(筛选阈值为qvalue<0.005且|log2FoldChange|>1)，筛选出了一条具有ERF/AP2结构域蛋白的Unigene PsiERF，将核苷酸序列提交到NCBI进行比对，结果显示，其与白梨预测的乙烯转录响应因子(LOC103964489)具有99%的相似度，与苹果预测的乙烯转录响应因子(LOC103401371)具有97%的相似度。序列分析结果显示，PsiERFcDNA序列的长度是1 195 bp，包含一个编码264个氨基酸长度为795 bp的开放阅读框(ORF)，一个123 bp的5，端非编码区和一个277 bp的3，端非编码区。用ProtParam分析可得，该基因编码蛋白的分子组成为C1 253H1 967N371O407S7，分子量为28.965 06 kDa，等电点为5.78，不稳定系数为47.05，总平均亲水性值为-0.726，包含一个保守的AP2/ERF结构域，推测此蛋白质为不稳定亲水性蛋白质。SignalP分析，PsiERF没有跨膜和信号肽显现，为非分泌蛋白质。 图1

2.2 蛋白质的二级结构预测

通过PRABI Lyon Gerland对PsiERF基因的蛋白质二级结构进行预测。发现PsiERF的主要的二级结构元件是不规则的盘绕(63.26%)、α-螺旋(23.86%)和延伸链(12.88%)。图2

2.3 PsiERF基因在白梨基因组中的位置

通过分析PsiERF在白梨基因组中的位置发现，PsiERF基因是白梨scaffold 520.0 基因组上246 130～247 324 nt长为1 194 bp的序列，无内含子。

2.4 系统发育

通过BLASTP分析发现PsiERF的氨基酸序列与其它蔷薇科植物的ERF具有高度同源性，如与白梨(Pyrus×bretschneideri, XP_009375704.1)98%、苹果(Malus domestica，XP_008338309.1)85%、日本杏(Prunus mume，XP_008241498.1)53%、樱桃(Prunus avium XP_021824713.1)50%、桃(Prunus persica，XP_007204172.1)51%等都具有一定的同源率，普遍达到了50%以上。通过DNAMAN对这6条氨基酸序列进行比对，发现它们的N端具有高度保守性。图3

利用MEGA7.0软件构建PsiERF与其它17条包含AP2/ERF结构域的物种氨基酸序列的系统进化树，研究表明，PsiERF与白梨(XP009375704.1)苹果(XP008338309.1)同属一个亚群，并且于白梨(XP009375704.1)的同源性最高。图4

加粗字体分别为起始密码ATG和终止密码TAG;下划线所标部分为AP2/ERF结构域保守区;下划线下斜体标示出的是ERF亚家族特征氨基酸丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)

ATG(initiation codon)and TAG(termination codon)are bold;The conserved AP2/ERF domain is underlined; Alanine and asparaginic acid(typical amino acid of ERF subtribe) are italic

图1 PsiERF基因的核苷酸序列及推定的氨基酸序列
Fig.1 Sequences of nucleotide and putative amino acid of the PsiERF gene

蓝线代表α-螺旋，紫线代表不规则盘绕，红线代表延伸链

The blue line represents the alpha helix，the purple line represents the random coil，the red line represents the extended strand

图2 PsiERF 基因的蛋白质二级结构预测
Fig.2 Prediction of the protein secondary structure of PsiERF

黑色背景的白色字母表示一致的氨基酸，红色背景字母表示一致性高于75%的氨基酸，蓝色背景字母表示一致性高于50%的氨基酸

Identical amino acids are in white letters with black background. Red background indicates amino acid with ≥ 75% identity and the blue background indicates amino acid with ≥ 50% identity

图3 PsiERF与其它含有AP2/ERF结构域蛋白的多重比对
Fig.3 Amino acid sequence alignment of PsiERF and other proteins containing the AP2/ERF domain

图4 不同来源ERF氨基酸序列的系统进化树
Fig.4 Phylogenetic tree of ERF amino acid sequence in different sources

2.5 实时荧光定量PCR

研究表明，PsiERF(ERF109)基因在宿萼组全花样品中的表达量较脱萼组全花样品高，而且在始花期和末花期表现出极显著差异；该基因在两组样品中均是在始花期表达最高，且均极显著高于盛花期和末花期，在末花期，宿萼组全花样品中的表达量极显著高于脱萼组全花样品中的表达量；PsiERF基因在末花期萼片中的表达量极显著高于始花期，在始花期和盛花期，子房中的表达量均高于萼片中的表达量，但是在末花期，萼片中的表达量极显著的高于子房中的表达量。PsiERF基因在末花期脱萼组中子房和萼片中的表达无明显差异，且显著低于始花期和盛花期。图5

不同小写字母表示在P<0.05水平具有显著性差异，不同大写字母表示在P<0.01水平具有极显著性差异；l、s、m分别表示初花期、盛花期、末花期

Different small letters within a panel indicate significant differences atP<0.05, different capital letters within a panel indicate significant differences atP<0.01; l, s, m indicate early bloom, full bloom and late bloom respectively

图5 PsiERF在脱萼组和宿萼组不同花器官全花、子房、萼片不同花期表达
Fig.5 Level of the relative expression of PsiERF in whole flowers，ovaries，and sepals with or without the calyx group

3 讨 论

研究通过分析PsiERF(ERF109)基因的序列、结构、蛋白质结构以及PsiERF基因在脱萼和宿萼样本中全花、子房，萼片各时期的表达情况，以及前人关于AP2/ERF家族性质以及库尔勒香梨脱萼宿萼影响因素的相关研究，来分析PsiERF基因与库尔勒香梨脱萼、宿萼这一生理现象有什么样的关系。

ERF家族包含1个AP2/ERF结构域，可以分为2个大的亚家族，CBF/DREB亚家族和ERF亚家族。DREB亚家族和ERF亚家族的主要区别在AP2/ERF结构域的第14位和第19位氨基酸残基，DREB亚家族的第14位和第19位氨基酸分别是缬氨酸和谷氨酸，而ERF亚家族是丙氨酸和天冬氨酸[20]。根据分析可知，PsiERF是属于ERF亚家族中的成员。ERF亚家族成员可识别GCC盒(AGCCGCC)，应答生物胁迫和非生物胁迫，功能广泛[35]。

调节植物组织衰老、脱落、死亡的激素有很多，如脱落酸、赤霉素、生长素、乙烯等[36]。研究表明，果萼中较高水平生长素和赤霉素以及较低水平的脱落酸有利于果萼宿存[37]。除此之外，影响植物组织的程序性死亡的因素还包括低温这一非生物胁迫。有研究表明，低温会促进香梨的脱萼[38]。ERF调控赤霉素的表达以及对低温产生应答。在水稻(Oryzasativa)中，ERF109的高表达会降低乙烯的合成，间接影响赤霉素的合成[39]。在佛手(Citrus me～ca L. vat. Sarcodactylis Swingle)中,ERF的高表达会增加植物对低温的抗逆性[40]。实验实时荧光定量显示，PsiERF在宿萼组中全花样品在始花期、盛花期、末花期的表达量都高于脱萼组全花样本，并且在始花期和末花期表现出极显著差异，并且在宿萼组末花期，萼片中PsiERF表达量极显著高于子房而在脱萼组末花期，萼片与子房中PsiERF表达量低并且无显著差异。由此推测，PsiERF基因决定香梨脱宿萼的关键时期是在末花期，且PsiERF低表达能够促进萼片脱落。由宿萼组子房萼片样本末花期数据可以看出，PsiERF在萼片中的表达量极显著高于子房，PsiERF在萼片中的表达量高低是影响香梨萼片脱落和宿存的关键因素。综上所述，库尔勒香梨中，PsiERF基因能够通过响应调控影响植物程序性死亡的激素，由此来影响香梨的萼片宿存与脱落。

4 结 论

克隆鉴定一个新的库尔勒香梨ERF109基因，命名为PsiERF。该基因cDNA序列长度为1 195 bp，编码264个氨基酸序列，在第14位和第19位分别丙氨酸和天冬氨酸，是属于AP2/ERF家族中的ERF亚家族。同源性分析结果表明，与白梨和苹果的ERF109亲缘较近，分别达到了95%与85%。实时荧光PCR结果显示，PsiERF在宿萼组样品中表达量均高于脱萼组，特别是在始花期与末花期呈现极显著(P<0.01)差异。宿萼组末花期，萼片中PsiERF的表达量极显著(P<0.01)高于子房中的表达量。脱萼组末花期，萼片中PsiERF的表达量和子房中的表达量无明显差异。故推测该基因在萼片中表达的高低与库尔勒香梨萼片宿存和脱落密切相关。