无创性肢体缺血预适应对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及缺血下肢的影响

高广生　潘蕊　苗晓东　李虹　聂亚东　刘淑华　李姝婷　朱东放　李懿宏

[摘要] 目的 观察无创性肢体缺血预适应对糖尿病下肢缺血大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及对缺血下肢的影响。方法 将成功建模的糖尿病下肢缺血大鼠随机分为2组（每组27例）：心肌缺血/再灌注组（A组）及预适应组（B组）。A组大鼠冠状动脉左前降支结扎30 min后开通2 h；B组大鼠缺血下肢行结扎5 min后开通5 min，共3次，连续3 d，第4天同A组实验。观察比较两组大鼠心电图ST段变化程度、肌酸激酶同工酶（CK-MB）值、缺血心肌质量与左心室质量的比值（AAR/LV）、梗死心肌质量与左心室質量的比值（IA/LV）、梗死心肌质量与缺血心肌质量的比值（IA/AAR）以及缺血下肢与健肢的血流值比率（R/L）。 结果 与A组相比，B组ST段抬高幅度、CK-MB值、IA/LV、IA/AAR值明显降低，R/L有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.01）。 结论 无创性肢体缺血预适应能明显降低大鼠心肌缺血/再灌注时的ST段抬高幅度、CK-MB值及心肌梗死面积，且对已发生缺血的下肢无显著影响。

[关键词] 缺血预适应；糖尿病；心肌梗死；缺血下肢

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2018）07（a）-0054-03

无创性肢体缺血预适应是指预先对一肢体进行缺血处理，对随后发生的远隔器官的缺血损伤有保护作用。很多动物实验及临床研究都证实了缺血预适应的心脏保护作用[1]，但关于缺血预适应对合并糖尿病的患者或动物的心脏保护作用的研究相对较少，且结果不一[2-4]。同时，因临床上很多糖尿病患者伴有肢体外周血管病变，而缺血预适应对病变肢体血管的影响尚无临床及动物研究。该研究拟建立糖尿病并下肢慢性缺血的大鼠模型[5]，观察无创性缺血预适应对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及对缺血下肢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 6～7周龄健康雄性Wistar大鼠60只，体质量200～250 g，由哈尔滨市呼兰区杨林乡鼎盛养殖场提供并饲养。

1.1.2 试剂 柠檬酸钠缓冲液、戊巴比妥钠、水合氯醛、CK-MB试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司），链硫脲菌素、Evans blue染色剂（美国sigma），TTC染色剂（上海化学试剂公司）。

1.1.3 设备 血糖仪（罗氏）、激光多普勒血流成像仪（瑞典）、多功能电生理仪（华南医用电气）、超低温高速离心机（Backman Coulter）、电热恒温振荡水浴箱（上海）、冰箱（新飞）、电子分析天平（Mettler Toledo）。

1.2 模型建立与分组实验

1.2.1 糖尿病模型的建立 高脂饲料（热量比为蛋白质：脂肪：碳水化合物=1∶3∶1）饲养60名大鼠，6个月后，做标记并称质量，禁食12 h，不禁水，柠檬酸钠缓冲液稀释链脲佐菌素，按35 mg/kg的剂量腹腔注射，48 h后用血糖仪测尾静脉血糖，以随机血糖>16.7 mmol/L为造模成功，7 d后复测随机血糖>16.7 mmol/L的大鼠入选实验，共58只大鼠入选。

1.2.2 下肢缺血模型的建立 58只大鼠均取右下肢造模，左下肢作为对照。2%戊巴比妥钠以50 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉后，取仰卧位，四肢牵拉固定于手术台，右下肢备皮消毒，于右侧腹股沟处纵行切开右下肢正中的皮肤，暴露血管神经束，分离出股动脉并结扎，激光多普勒血流仪记录双下肢血流灌注值，以右下肢比左下肢血流减少约70%确认建模成功，28 d后复测右下肢/左下肢血流比率<75%的大鼠入选实验，共54只大鼠入选。

1.2.3 进行无创性肢体缺血预适应及心肌缺血/再灌注 将成功建模的54只大鼠随机分为2组：缺血/再灌注组（A组）及预适应组（B组），各27只。A组大鼠以10%水合氯醛以0.3g/kg的剂量腹腔注射麻醉后，连接肢导心电，气管切开，呼吸机辅助呼吸，在左锁骨中线3、4肋间处行纵形切口，以小型开胸器暴露胸腔。切开心包，在冠状动脉左前降支中、上1/3交界处以丝线结扎30 min后，松开丝线使冠状动脉开通至2 h。B组大鼠用2%戊巴比妥钠溶液以30 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉后，以橡皮筋捆绑大鼠右下肢根部至超声示下肢动脉血流消失，持续5 min，再松开5 min，如此捆绑/松开共3次，连续3 d，第4天操作同A组。

1.3 观察指标的测定

1.3.1 心电图 分别在心梗前、心梗后30 min、再灌注后30 min、再灌注后2 h测心电图ST段抬高幅度。

1.3.2 心肌酶 于再灌注后2 h于右心室取血2 mL，凝固并离心后取血清测CK-MB 值。

1.3.3 心肌梗死面积 右心室取血后结扎左前降支，将Evans blue染色剂从主动脉逆行注入心脏，剪下心脏后用生理盐水冲洗干净，放入冰箱中冷冻20 min。垂直心脏长轴方向切片（厚约1 mm）。电子天平称量左心室质量（LV），再剔取缺血部分（未染色部分）称质量（ARR），并计算缺血部分质量占左心室质量的百分比（AAR/LV）。将缺血部分切片放入TTC中，37℃水浴30 min，梗死部分呈苍白色，剔取梗死部分的心肌称质量（IA），并计算梗死部分质量占左心室质量的百分比（IA/LV），最后计算梗死部分质量与缺血部分质量的百分比（IA/AAR）。

1.3.4 下肢血流值 用激光多普勒血流仪分别记录预适应组大鼠在预适应前、心梗后30 min及再灌注后2 h双下肢血流灌注值，以右下肢/左下肢的血流比率（R/L）表示血流灌注程度。

1.4 统计方法

处理采用SPSS 20.0统计学软件分析，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ST段抬高幅度

两组大鼠心梗前心电图ST段抬高幅度无明显差异（P>0.05），与A组相比，B组大鼠在心梗后30 min、再灌注后30 min及再灌注后2 h心电图ST段明显回落（P<0.01），见表1。

2.2 心肌酶

与A组相比，B组大鼠CK-MB值明显降低（P<0.01），见表2。

2.3 心肌梗死面积

两组大鼠心肌缺血范围（AAR/LV）无显著差异（P>0.05），与A组相比，B组大鼠心肌梗死范围（IA/LV、IA/AAR）明顯缩小（P<0.01），见表2。

2.4 下肢血流灌注程度

与A组相比，B组大鼠在预适应前、心梗后30 min及再灌注后2 h其下肢血流灌注比率略有下降，但其差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

3 讨论

2001年NCEP ATPⅢ（美国胆固醇教育计划成人治疗第三次报告）提出糖尿病是冠心病的“等危症”[6]，此后，糖尿病与冠心病的联系受到国内外内分泌及心血管医生的广泛关注。相比较单纯冠心病患者，合并糖尿病的患者心梗的面积更大、死亡率更高，并且心梗的再发率也更高[7]。因此，有效防治糖尿病患者的心肌损伤，对提高其生存率和生活质量具有重要意义。

心梗之后，及时恢复缺血区的血液灌注是减小心梗面积，提高临床治愈率的重要手段。但再灌注本身也会对缺血区的心肌造成进一步的损伤，即缺血/再灌注损伤。缺血预适应（IP）是指机体组织在经历反复的短暂的非致死性缺血/缺氧后，对随后的长时间致死性缺血/缺氧具有高耐受性，这主要表现在实质性细胞死亡显著减少，梗死范围显著减小，并显著减轻器官功能障碍，但其缺点是直接作用于靶器官，不适合应用于心脏、脑等器官。无创性肢体缺血预适应（NLIP）是指通过对不太重要的肢体进行缺血预适应，可产生对心脏、脑等重要器官的保护作用，减轻缺血/再灌注损伤，比手术治疗[8-9]和药物治疗[10]更具优势，有较高的临床应用价值。

心电图ST段抬高是心梗的重要特征，在某种程度上可反映心肌细胞的损伤程度，该研究表明无创性肢体缺血预适应可明显降低心梗后ST段抬高幅度，减轻心肌细胞损伤。心肌酶学是评价心肌梗死的重要指标，其中CK-MB主要存在于心肌细胞，诊断心肌梗死的敏感性达82.35%、特异性达94.74%，该研究表明无创性肢体缺血预适应可明显降低CK-MB升高水平，对心肌细胞有保护作用。心肌梗死面积是评价心肌缺血/再灌注损伤程度的金标准[11]，该研究证实无创性肢体缺血预适应可显著缩小心肌梗死面积，减轻缺血/再灌注损伤程度。临床上很多糖尿病患者同时伴有肢体外周血管病变，该研究观察通过对已发生血管病变肢体的缺血预适应，在减轻心肌缺血/再灌注损伤的同时并未对病变肢体产生明显不良影响。

综上所述，无创性肢体缺血预适应能对大鼠心肌缺血/再灌注损伤产生明显的保护作用，且对已发生血管病变的下肢无显著影响。其产生保护作用的机制目前尚未完全明了，可能与内源性腺苷释放增加及其受体的激活[12-13]、氧自由基产生减少[14]、炎性细胞的聚集及心肌细胞的凋亡减少[15-16]等因素有关。另外，研究中发现，在心肌梗死或再灌注的不同时期进行缺血预适应所产生的心肌保护作用强度可能存在差异，其差异程度仍有待进一步研究。

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（收稿日期：2018-04-13）