脾虚对哮喘*大鼠脂质介质合成酶的影响及捏脊法的效应研究

★ 熊英 宋志秀 顾云 陆金路 韦姜飞 秦宇航 朱延（.南京中医药大学 南京003；.南京中医药大学第二临床医学院针药结合教育部重点实验室 南京 003）

哮喘是儿童最常见的呼吸道疾病之一，内源性的特异性促炎症消退介质（SPMs）调控障碍被认为是哮喘急性炎症不能及时消退，并转为慢性炎症的重要原因［1］。中医学认为，脾虚是儿童哮喘的重要病理基础［2］。笔者前期临床研究发现，脾虚与患有哮喘等过敏性疾病儿童的过敏体质密切相关［3］；动物实验研究也提示，脾虚导致哮喘大鼠促炎症消退介质水平升高受限，促炎和促炎症消退介质之间平衡紊乱，哮喘炎症消退减缓等［4-5］。还有研究表明，脾虚使哮喘大鼠肺组织核转录因子κBp65 （NF-κBp65）的活性进一步增加［6］，而 NF-κBp65 活化与哮喘时多种炎性蛋白的高表达有关［7］。

捏脊法是防治儿童哮喘的常用外治法，有较好的临床效果［8-9］。动物实验研究结果也显示，捏脊法可有效改善脾虚哮喘大鼠的肠道菌群失调，改善促炎和促炎症消退介质之间的失衡，有助于肺部炎症的消退［4-5］。

环氧合酶-2（COX-2）、5-脂氧合酶（5-LO）和15-LO 是参与促炎和促炎症消退介质类别转换和合成的关键酶［1］，因而可能在哮喘炎症的转归中有着重要作用［10］。因此，本研究欲通过观察脾虚对哮喘大鼠COX-2、5-LO、15-LO水平和NF-κBp65活化程度的影响以及捏脊法的干预作用，以探索脾虚为儿童哮喘重要病理基础的依据以及捏脊法的效应机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 雄性SPF级SD幼鼠42只（体重40.0～50.7g），由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（许可证号：SCXK（沪）2007-0005）。按照随机数字法，将SD幼鼠分成4组：对照组（n=6），哮喘组（n=12），脾虚哮喘组（n=12），脾虚哮喘捏脊组（n=12），各组大鼠体重无明显差异（P＞0.05）。实验室光照适度，洁净程度及通风条件良好，室温（22℃±2℃），湿度50%～70%，常规饲料喂养。

1.2 主要药物、试剂及仪器 实验中所用中药材由南京中医药大学国医堂门诊部提供，冷水浸泡30min，煎煮2次后将药液合并，且浓缩至1mL/g的原药材。卵蛋白（OVA，Grade V，Sigma公司，货号A5503），酶联免疫（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），NF-κB p65兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），雾化器（江苏鱼跃器械有限公司），Rayto RT-6100酶标分析仪，DP71/BX60型显微镜（Olympus Corp.，Tokyo， Japan）。

1.3 脾虚哮喘大鼠模型的建立 以破气耗气加饥饱失常方法建立脾虚模型，继而采用OVA致敏和激发方法建立哮喘模型［5］，对照组和哮喘组以自来水灌胃，对照组以生理盐水致敏与激发。

1.4 捏脊法干预 助手轻轻固定大鼠头尾部，操作者先以指腹从大椎沿脊柱正中轻抚大鼠背部皮肤至尾根部3遍；再以双手拇食指轻轻对称提起大鼠背部中线两侧的皮肤，并以指腹相对用力，紧贴中线从尾根部捏至大椎穴处，共7遍，最后以3遍捏三提一结束，力量以大鼠不尖叫且较平静为度。捏脊法干预在脾虚造模第10天始至OVA致敏前每周一、三、五、日各操作1次，OVA致敏期间每日操作1次。

1.5 ELISA检测大鼠肺组织COX-2、5-LO和15-LO水平 右肺叶部分组织剪成小块分装于冻存管，投入液氮后储存于-80℃冰箱储存待测。ELISA检测严格按照相应试剂盒说明进行，测定吸光度值并换算成浓度水平。

1.6 免疫组化检测并计算NF-κBp65细胞入核的百分比 采用免疫组织化学SABC（Strept Avidin-Biotin Complex）法检测，操作步骤按说明书进行。以细胞核着棕黄色为NF-κBp65入核细胞，主要观察肺内小支气管及其周围部位，每张切片随机选取5个高倍视野（X400），计算NF-κBp65入核细胞数占总细胞数的百分比，取平均值作为该切片的代表值，以此表示其活性程度。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织COX-2、5-LO和15-LO水平 见表1。与对照组比较，在哮喘造模结束后18h和42h，哮喘组、脾虚哮喘组和脾虚哮喘捏脊组的COX-2水平均明显上升（P均＜0.01），且各组42h水平均显著高于18h时（P均＜0.01）。脾虚哮喘组18h和42h 的COX-2水平均显著高于哮喘组（P均＜0.01），而脾虚哮喘捏脊组18h和42h的COX-2水平均显著低于脾虚哮喘组（P均＜0.01）。

与对照组比较，在哮喘造模结束后18h和42h，哮喘组、脾虚哮喘组和脾虚哮喘捏脊组的5-LO水平均明显上升（P均＜0.01），且各组42h水平均显著高于18h时（P均＜0.01）。脾虚哮喘组18h和42h的5-LO水平与哮喘组均无明显差异（P均＞0.05），而脾虚哮喘捏脊组18h和42h的5-LO水平也与脾虚哮喘组无明显差异（P均＞0.05），18h时却明显高于哮喘组（P＜0.05）。

与对照组比较，在哮喘造模结束后18h和42h，哮喘组、脾虚哮喘组和脾虚哮喘捏脊组的15-LO水平均明显上升（P均＜0.01），且各组42h水平均显著高于18h时（P均＜0.01）。脾虚哮喘组18h的15-LO水平与哮喘组无明显差异（P＞0.05），但42h已显著低于哮喘组42h的水平（P＜0.01），而脾虚哮喘捏脊组18h和42h的15-LO水平均显著高于脾虚哮喘组（P均＜0.01），且明显高于哮喘组（P均＜0.01）。

表1 各组肺组织脂质介质合成酶的水平比较（） pg/mL

表1 各组肺组织脂质介质合成酶的水平比较（） pg/mL

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与哮喘组（18h）比较，▼▼P＜0.01；与脾虚哮喘组（18h）比较，＊＊P＜0.01；与哮喘组（42h）比较，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05；与脾虚哮喘组（42h）比较，★★P＜0.01，★P＜0.05；与捏脊脾虚哮喘组（18h）比较，◇◇P＜0.01。

组别 n COX-2 5-LO 15-LO正常对照组 18h 6 129.00±6.74 861.47±100.58 625.18±41.06哮喘组18h 6 196.01±10.77△△ 1300.48±63.57△△ 685.67±16.98△△42h 6 233.00±15.18△△▼▼ 1946.60±115.62△△▼▼ 817.50±31.49△△▼▼脾虚哮喘组18h 6 244.29±16.65△△▼▼ 1376.91±75.65△△ 674.16±35.66△△42h 6 270.09±20.38△△＊＊☆☆ 2016.54±226.00△△＊＊ 762.58±26.16△△☆☆＊＊脾虚哮喘捏脊组18h 6 218.32±13.73△△▼＊＊ 1496.84±239.74△△▼ 780.35±31.03△△▼▼＊＊42h 6 244.25±20.78△△★★◇◇ 2026.52±148.58△△◇◇ 870.71±17.01△△☆☆★★◇◇

2.2 免疫组化测定肺组织NF-κBp65的活性 见图1。NF-κBp65进入细胞核是其被激活的表现，NF-κBp65入核的细胞数占细胞总数的比例为其活性程度。免疫组化结果显示，与对照组相比，各组NF-κBp65活性均显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。

哮喘组和脾虚哮喘捏脊组42h的NF-κBp65活性均比18h明显降低（P均＜0.05），但脾虚哮喘组42h与18h并无显著差异（P＞0.05）。脾虚哮喘组42h的NF-κBp65活性显著高于哮喘组42h时水平（P＜0.05），脾虚哮喘捏脊组18h和42h的NF-κBp65活性均显著低于脾虚哮喘组（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 肺组织NF-κBp65的活性比较

3 讨论

ω-6长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）为必需脂肪酸，其中的花生四烯酸（AA）一方面可通过5-LO合成半胱氨酸白三烯（CysLTs），或者通过5-LO与15-LO/12-LO的共同作用合成脂氧素（LXs）；另一方面也可通过COX-2合成包括前列腺素 E2（PGE2）在内的 PGs［11］。在炎症消退时的脂质介质类别转换过程中，COX-2途径的PGs在较低水平时即可启动从5-LO活性占优势向15-LO活性占优势的转换，并促进经15-LO途径的SPMs合成［12］。但过多的COX-2表达也可能会抑制5-LO和15-LO基因的表达［13］。本研究显示，脾虚导致COX-2水平的异常升高，这与前期研究显示的脾虚导致PGE2水平异常升高的结果是一致的［5］。而各组COX-2水平在42h比18h水平仍显著升高，与NF-κBp65活性变化结合来看，提示在这两个时间节点间可能还存在炎症高峰期。

CysLTs和LXs均为AA的代谢产物，LXA4/CysLTs若出现不平衡，可导致哮喘发作或加重。CysLTs为促炎介质，5-LO是其合成的关键酶，在体内主要由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、单核细胞和上皮细胞通过单细胞或者跨细胞途径合成；以LXA4为代表的LXs为促炎症消退介质，5-LO和15-LO 是其合成的关键酶［10，14］。

笔者前期的研究结果表明，脾虚导致哮喘炎症的消退延缓，可能与LXA4/CysLTs之间的失衡有关［5］。本研究结果显示，脾虚导致15-LO水平升高缓慢，这与脾虚导致LXA4升高缓慢，使LXA4/CysLTs失衡的结果是一致的；但脾虚并未导致5-LO水平的明显变化，这可能与5-LO同时参与促炎介质和促炎症消退介质生成的双重角色有关。

捏脊法既是一种外治法，又是小儿推拿最常用的手法之一，防治儿童哮喘有较好的临床效果［8-9］。捏脊法循督脉和足太阳膀胱经操作，善于健脾、调理脏腑［15］。本研究显示，捏脊法有助于降低脾虚大鼠肺组织的COX-2水平，提升15-LOX水平，并减轻NF-κBp65的激活，这可能是其改善脾虚哮喘促炎/促炎症消退介质平衡，促进肺部炎症消退的机制之一。

本研究表明，脾虚导致哮喘大鼠15-LO水平升高缓慢，COX-2水平异常升高，肺组织NF-κBp65的活性增加。捏脊法可提升脾虚哮喘大鼠肺组织15-LO水平，降低COX-2水平，降低NF-κBp65的活性，这可能是其干预儿童哮喘的重要机制之一。