基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子

王迎春，刘娇，倪晓蒙，雷宇，郑平，刁爱坡



基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子

王迎春1,2,3，刘娇2,3，倪晓蒙2,3，雷宇3，郑平2,3，刁爱坡1

1 天津科技大学 生物工程学院，天津 300457 2 中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308 3 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308

王迎春, 刘娇, 倪晓蒙, 等. 基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子. 生物工程学报, 2018, 34(11): 1760–1771.Wang YC, Liu J, Ni XM, et al. Screening efficient constitutive promoters in Corynebacterium glutamicum based on time-series transcriptome analysis. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1760–1771.

启动子是重要的转录调控元件，广泛用于工业菌株的代谢工程改造。谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株，但已报道的组成型强启动子较少。对谷氨酸高产菌SL4发酵过程的10个时间点样品进行转录组测序，筛选在发酵过程中稳定转录并且转录水平最高的10个基因；分别克隆其启动子序列至红色荧光蛋白 (RFP) 报告系统，通过荧光强度表征启动子在SL4菌株中的强度，再在野生型ATCC 13869和ATCC 13032中验证部分启动子的通用性；并采用LacZ蛋白进一步评价强启动子的表达效果。结果显示，成功筛选到3个可以通用的组成型启动子P、P和P。其中P的表达强度最高，与诱导型强启动子P对比，在SL4和13869菌株中均达到其2倍 (RFP) 和4倍 (LacZ) 以上；在ATCC 13032菌株中，P的表达强度为P的0.3−0.4倍。P首次被报道为强启动子，可用于谷氨酸棒杆菌强化合成途径的代谢工程改造。

谷氨酸棒杆菌，时间序列转录组，启动子，RFP报告系统

谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸工业生产菌株，主要用于生产L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-异亮氨酸等氨基酸[1]。谷氨酸棒杆菌可以适应简单原料和复杂环境，耐受高浓度碳源[2]，并已被美国FDA认证为安全(Generally recognized as safe，GRAS) 的微生物[3]，近年来又被广泛用于生产生物乙醇和异丁醇等生物燃料[4-6]、琥珀酸和乳酸等有机酸、二元胺和聚羟基丁酸脂等生物材料单体[7-9]以及重组蛋白等生物大分子[10]。代谢工程强化目标产物的合成途径是提升工业菌株性能的常用策略，其中利用强启动子构建高效的转录表达盒已经被证明是非常有效的手段[3,11–12]。

谷氨酸棒杆菌中关于诱导型启动子的研究较多，例如已经成功地构建了IPTG (Isopropyl- β-dthiogalactopyranoside)诱导型、麦芽糖诱导型、葡萄糖酸诱导型、阿拉伯糖诱导型、鼠李糖诱导型、乙酸诱导型、四环素诱导型和丙酸诱导型等诱导型启动子[13–16]。在代谢工程改造中，诱导型启动子可以通过改变诱导剂浓度实现不同强度表达，使用最多的是IPTG诱导启动子，如P和P。然而由于其需要添加诱导剂，近年来谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造更倾向使用组成型启动子。常用的内源组成型启动子包括P、P、P和P。Tateno等[17]和Vogt等[18]利用P启动子分别提高L-赖氨酸和L-异亮氨酸的产量。Park等[19]和Kim等[20]利用P启动子分别提高L-精氨酸和L-鸟氨酸的产量。Park等[19]和Jensen等[21]利用P启动子分别提高L-精氨酸和L-谷氨酸衍生物的产量。随着合成生物学的发展，研究者开始发展人工合成启动子。Yim等[22]通过人工合成完全随机的70 bp序列，再基于GFP筛选了系列强度启动子，并且应用于木聚糖内切酶等的分泌生产。Rytter等[23]基于谷氨酸棒杆菌启动子–10区共有序列和大肠杆菌启动子–35区共有序列设计并筛选了人工启动子。

目前已经表征的组成型启动子的表达强度大多低于完全诱导的P等启动子。Ravasi等[24]用GFP作为报告系统进行比较，结果显示P和P启动子的表达强度分别约为P的0.5和0.1倍。Shang等[25]用LacZ作为报告系统表征部分内源启动子，结果显示P和P启动子的表达强度分别约为P的0.7倍和0.3倍，只有P启动子的表达强度比P高，约为P的1.35倍。因此依然需要挖掘更多高表达强度的组成型启动子。

转录组和蛋白质组学可以系统地表征基因的表达水平，近年来已经被用于筛选启动子元件。Zhao等[26]从谷氨酸棒杆菌蛋白组数据中显示高蛋白表达的12个基因中筛选到强组成型启动子P。蛋白组数据只能间接反映基因的转录水平，直接反映基因转录水平的转录组数据更有利于筛选高表达强度的启动子。刘秀霞等[27]通过分析谷氨酸棒杆菌高、中、低溶氧条件下的转录组数据，从不同条件下均高转录的6个候选基因中筛选到组成型强启动子P。本研究基于谷氨酸高产菌SL4发酵过程的时间序列转录组数据，筛选发酵过程均稳定转录且转录水平最高的10个基因；通过红色荧光蛋白(RFP) 报告系统在SL4菌株中表征这些基因的启动子强度，并采用野生型菌株和LacZ蛋白进一步验证部分启动子的通用性。最终获得了3个通用的组成型启动子，其中P首次被报道为强启动子，这些启动子均可用于谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

本研究所用菌株与质粒见表1。

表1 本研究所用菌株与质粒

1.1.2 引物设计与合成

本研究所用引物使用Vector软件设计，引物名称及序列如表2所示，引物均由苏州金唯智公司合成。

1.1.3 主要试剂与仪器

质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自北京TIANGEN公司；基因组提取试剂盒购自美国Biomiga公司；RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit) 购自QIAGEN公司；重组克隆试剂盒(ClonExpress®CE II) 购自南京Vazyme公司；酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司；卡那霉素等抗生素购自北京Solarbio公司；其余所有试剂均为国产分析纯。PCR热循环仪，Applied Biosystems公司；分光光度计，Shimadzu公司；Nanodro超微量核酸蛋白测定仪，Thermo Scietific公司；电击转化仪，Mettler Toledo公司；DM5000B荧光显微镜，Leica公司；SpectraMaxM5多功能连续酶标仪，Molecular Devices公司；Illumina MiSeq平台，Illumina公司。

表2 本研究所用引物

1.1.4 培养基

LB培养基：10 g/L NaCl，10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母粉，根据需要添加50 μg/mL卡那霉素，用于培养。LBG培养基：10 g/L NaCl，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，5 g/L葡萄糖，根据需要添加25 μg/mL卡那霉素，用于ATCC 13869和ATCC 13032培养。SGY培养基：5 g/L 葡萄糖，10 g/L酵母粉，18 g/L大豆蛋白胨，1 g/L K2HPO4·3H2O，10 g/L 尿素，0.5 g/L 丁二酸，10 μg/L生物素，pH调至7.1，根据需要添加25 μg/mL卡那霉素，用于SL4培养。

1.2 方法

1.2.1 构建基于RFP的启动子报告系统

以pEC-XK99E质粒为模板，以pEC-XK99E-F和pEC-XK99E-R为引物反向扩增得到线性化载体pEC-XK99E。以pSB4K5-质粒为模板，以-F和-R为引物扩增得到携带RBS序列的片段。由于引物-F和-R携带用于重组克隆的同源臂，使用重组克隆试剂盒，将扩增得到的片段与线性化载体pEC-XK99E进行重组连接，获得重组质粒pEC-XK99E-。采用100倍油镜在绿色激发光下显微镜观察荧光。

1.2.2SL4菌株的时间序列转录组测序及目标基因筛选

实验室前期在5 L发酵罐，采用温敏工艺(以葡萄糖为碳源，玉米浆、大豆蛋白胨和氨水调pH提供氮源，生物素充足) 分批补料发酵SL4菌株生产谷氨酸，初期发酵温度为33 ℃，8 h开始升温至36.5 ℃，其后逐渐升温至39.5 ℃，发酵周期28 h。本研究直接从发酵罐中取样，取样时间分别为1、3、5.5、8、9.5、11.5、13.5、15.5、18.5、23.5 h，菌体4 ℃离心快速收集，液氮速冻并保存于–80 ℃。液氮研磨菌体成粉末状，再采用QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒进行RNA的提取及纯化。RNA样品送中国科学院天津工业生物技术研究所技术支撑中心，在Illumina MiSeq平台上进行建库及双端150 bp测序，每个样品获得约1.5 G原始数据。测序数据经过质量过滤后，利用Samtools和HTSeq软件计算每个样本中每个基因的count值(每个基因比对上的reads数)，通过Python脚本和FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 公式计算每个样本中每个基因的FPKM值。计算每个基因10个时间点的FPKM平均值，根据(每个时间点的FPKM值−平均值)/平均值计算每个点的波动，筛选8个以上时间点的上下波动不超过平均值50%的基因(由于10个点波动都不超过50%会去掉大量高转录水平的基因)，再选择FPKM平均值最高的10个基因。

1.2.3 启动子的克隆及其RFP报告质粒的构建

基因的启动子序列由查阅文献分析比对菌株SL4的基因序列获得，选择全部上游非编码区作为其启动子序列，所有启动子表征时使用相同的5ʹ-UTR和SD序列(下划线)：5ʹ-GAGCGGATAACAATTTCACACAGGC CTTGAGAATG-3ʹ，ATG(加粗)为起始密码子。以SL4菌株的基因组为模板，采用相应的引物(表2) 扩增10个启动子片段。以pXMJ19质粒为模板，采用P-F和P-R引物扩增P启动子片段。以pEC-XK99E-质粒为模板，以△-F和△-R为引物反向扩增去除质粒中的P，获得线性化载体片段。使用重组克隆试剂盒，将启动子片段与线性化载体片段分别进行重组连接，获得含有不同启动子的11个报告质粒。所有报告质粒分别转化SL4、ATCC 13869和ATCC 13032菌株，获得表达荧光蛋白的重组菌。

1.2.4600和荧光值的测定

挑取平板活化的单克隆接入含20 mL SGY或LBG培养基的100 mL三角瓶中，30 ℃、220 r/min条件下过夜培养，取适量培养物转接入含30 mL SGY或LBG培养基的250 mL三角瓶中，使得初始600为0.5，在同样的条件下培养，每隔2−4 h取样检测600和荧光强度。每个样品3个平行。包含P和P启动子的对照菌株在接种时添加0.5 mmol/L IPTG。600稀释至合适浓度在酶标仪上测定。荧光强度测定，先用PBS缓冲液洗涤菌体2次，再稀释至合适浓度，在多功能连续酶标 仪上分别测定600和荧光值，激发波长为560 nm，发射波长为607 nm，荧光强度为测定的荧光 值/600。

1.2.5 LacZ表达质粒和菌株的构建及β-半乳糖苷酶活性的测定

分别以pEC-XK99E-、pWYC-11和pWYC-5质粒为模板，以△-F和△-R为引物反向扩增获得各质粒去除的质粒骨架；以质粒pZSP1为模板，以-F和-R为引物扩增得到片段。采用一步重组克隆试剂盒，将扩增得到的段与对应的质粒骨架进行重组连接，分别获得pEC-XK99E-、pWYC-12和pWYC-13重组质粒。所有质粒使用相同的5ʹ-UTR和SD序列(下划线)：5ʹ-GAGCGGATAACAATTTCACACAG GCCCACACCAGCTATG-3ʹ，ATG(加粗)为起始密码子。所有重组质粒分别电转化至3株谷氨酸棒杆菌中。

检测β-半乳糖苷酶活性：菌株培养与荧光测定相同，每个样品设定3个平行。取适量稳定期菌液冰上孵育20 min，再取0.5 mL 菌液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，用0.5 mL预冷的Z缓冲液(0.06 mol/L Na2HPO4·7H2O、0.04 mol/L NaH2PO4·H2O、0.01 mol/L KCl、0.001 mol/L MgSO4、0.05 mol/L β-巯基乙醇，pH 7.0) 重悬细胞，测定600。取0.1 mL上述样品加入100 µL 氯仿和50 µL 0.1% SDS，振荡混匀，30 ℃孵育 1 h。加入0.2 mL 30 ℃预热的反应底物ONPG (4 mg/mL)，混匀并开始计时，30 ℃孵育一定时间。当反应液充分变为黄色后，加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，振荡混匀，同时记录时间。在酶 标仪中测定420和550的数值，通过以下公式计算酶活：Miller Units=1000×(420–1.75×550)/ (600×菌液体积(mL)×反应时间(min))。

2 结果与分析

2.1 构建基于RFP的启动子报告系统

以作为报告基因，根据1.2.1所描述的方法，在大肠杆菌DH5α中构建pEC-XK99E-质粒(图1)，转化子菌落PCR验证和质粒测序都正确，表明重组质粒构建成功。将pEC-XK99E-质粒电转化至SL4中，获得SL4 (pEC-XK99E-) 菌株，荧光显微镜观察显示其可以表达红色荧光蛋白(图2)，表明RFP报告系统构建成功。

图1 pEC-XK99E-rfp质粒图谱

图2 C. glutamicum SL4 (pEC-XK99E-rfp) 菌株的荧光显微镜观察

2.2 C. glutamicum SL4菌株发酵过程的转录组测序及目标基因的筛选

根据1.2.2描述的方法，进行SL4菌株发酵过程10个时间点样品的转录组测序，并通过组学数据分析筛选候选基因。取样时间包括菌体生长和产酸的各个时期，可以全面地分析该菌株发酵过程的基因转录水平。由于常规谷氨酸棒杆菌RNA提取方法中的溶菌酶处理过程会改变胞内真实的RNA水平，本研究采用液氮研磨法提取10个样品的总RNA，所有样品的RNA浓度和完整性都可以达到测序要求。根据转录组的数据分析，筛选出发酵过程均稳定转录且转录水平最高的10个基因，其发酵过程的转录水平如图3所示，FPKM平均值及基因功能等如 表3所示，其中和基因的整体转录水平更高，其他8个基因转录水平差异较小。

图3 10个目标基因在发酵过程中的转录水平

表3 10个目标基因的功能、FPKM平均值和启动子长度

2.3 C. glutamicum SL4菌株中表征启动子的强度

按照方法1.2.3成功构建含不同启动子的报告质粒。将含有不同启动子表达RFP的SL4重组菌接入培养基中，按照1.2.4中的方法进行培养，并使用多功能酶标仪分别检测600和荧光强度，以稳定期35 h的荧光强度表征启动子强度。重组菌的生长情况如图4A和4C所示，与空质粒、P和P对照相比，所有菌的生长无明显差别，都在12 h即可达到稳定期，600约为6，说明这些启动子表达RFP不影响菌株生长。荧光强度检测结果如图4B和4D所示，前12 h所有启动子的荧光强度都较低，在12–23 h期间荧光强度逐渐增强，培养至23 h时基本达到最高，其后保持稳定。IPTG诱导型对照启动子P和P的强度和表达模式都基本一致，为了同文献对比，以P启动子的强度进行比较。P、P和P启动子为表达强度最高的3个组成型启动子(图4B)，其强度顺序为P>P>P，分别达到(1 190±31)、(163±3) 和(110±4) RFU/600，其强度分别为P的2.2、0.3和0.2倍；其余7个启动子的表达强度都更低。

图4 不同启动子表达RFP的C. glutamicum SL4系列重组菌的生长曲线及荧光强度

2.4 野生型谷氨酸棒杆菌中表征启动子强度

为了评价3个启动子P、P和P的通用性，将含有这3个启动子的报告质粒及对照质粒分别转入野生型ATCC 13869和ATCC 13032，并采用更通用的LBG培养基培养，以稳定期23 h的荧光强度表征启动子强度。与对照菌株相比，不同启动子表达RFP的ATCC 13869和ATCC 13032重组菌的生长无明显差别，说明在这2个菌株中不同启动子表达RFP均不影响菌株的生长。荧光强度检测结果如图5所示，P和P的强度和表达模式也基本一致，同样以P启动子的强度进行比较，在ATCC 13869菌株中，P、P和P启动子强度分别达到 (1 075±21)、(98±5) 和(72±5)RFU/600，强度及顺序与在SL4菌株中类似，其强度分别是P的2.1、0.2和0.1倍；在ATCC 13032菌株中，P、P和P启动子强度分别达到(154±2)、(77±6)和(48±6)RFU/600，强度顺序与在SL4和ATCC 13869菌株中类似，其中P和P启动子强度变化较小，分别为P的0.2倍和 0.1倍；但P启动子强度明显下降，只有P的0.3倍。

2.5 PcysK启动子用于LacZ蛋白表达

为了进一步评价强启动子P的蛋白表达效果，分别在SL4、ATCC 13869和ATCC 13032菌株中验证其表达LacZ的效果，并以P和P启动子为对照。测定蛋白表达稳定期的β-半乳糖苷酶活性，结果如图6所示，P和P启动子在3株菌中的表达效果相似，也以P进行比较，在SL4和ATCC 13869菌株中，P启动子表达的LacZ活性分别约为P的4.1和 4.3倍；在ATCC 13032菌株中，P启动子表达的LacZ活性约为P的0.4倍。以上结果表明，P启动子表达LacZ的趋势与RFP一致，但在SL4和ATCC 13869菌株中可以更加高效地表达LacZ。

图5 PcysK、PgapA和PfumC启动子表达RFP的C. glutamicum ATCC13869和ATCC 13032系列重组菌的荧光强度

图6 PcysK启动子在C. glutamicum SL4、ATCC 13869和ATCC 13032菌株中表达LacZ

3 讨论

随着谷氨酸棒杆菌在现代生物技术产业中被越来越多地用于生产更多产品，需要挖掘更多的表达元件用于遗传育种改造，从而实现高效生产不同目标产物[10,30]。相比于诱导型启动子，高效的组成型启动子逐渐展现出优势[31–33]。本研究 采用RFP报告系统，从发酵过程均高水平转录的10个基因中筛选到3个内源组成型启动子，其中P启动子首次被报道为强启动子，为谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造提供了新的表达元件。

多种条件或多个时间点的转录组数据，可以反映每个基因的转录水平和转录模式，从而可以帮助筛选所需类型的启动子元件。本研究基于发酵过程的时间序列转录组数据筛选的10个发酵过程均高水平转录的基因，与刘秀霞等[27]通过分析不同溶氧条件转录组数据筛选的6个不同溶氧条件均高水平转录的基因相比，只有基因是共有的，其基于EGFP报告系统表征P启动子为强启动子，而在本研究中采用RFP报告系统表征发现P的强度很低。与其相比，本研究选取的P启动子长度更长。Ravasi等[24]发现不同报告基因对相同启动子的评价结果也存在较大差异。因此我们认为启动子序列、报告基因、菌株和培养条件的差异是造成P启动子表征结果不同的主要原因。此前报道的组成型启动子P和P，其起始转录的基因在发酵过程中均可以稳定转录，但平均转录水平没有排在前10位，因此没有入选。另外，本研究中多个基因基于RFP报告系统表征的启动子强度与转录组数据中的转录水平FPKM值并不一致，该现象在其他已报道的类似研究中同样存在。在原核生物中启动子是影响基因转录水平的主要因素，因此一般来说，以全基因组规模的转录组数据筛选内源启动子是一种可行的初筛方法。但是由于基因的转录水平也受基因序列(包括报告基因)、基因的拷贝数、DNA的二级结构、mRNA的稳定性和基因转录的外部环境条件等的影响，所以高转录水平的基因不一定都能通过报告系统表征出强启动子。蛋白质的表达水平还与5ʹ-UTR、SD序列、mRNA的二级结构和密码子使用频率等相关，所以当采用相同的5ʹ-UTR、SD序列和报告基因表征不同启动子时，可以通过RFP等报告蛋白的表达量来表征不同启动子在相同条件的强度，但是如果以上因素发生变化时，启动子强度也可能不同。由此可见，以上因素都可能导致报告系统表征的启动子强度与转录组数据中的转录水平不一致，研究者在使用相关结果时应当全面慎重评估。

为验证本研究发现的3个内源组成启动子的普适性，又分别在ATCC 13869和ATCC 13032菌株中进行了表征和效果评价。在SL4和ATCC 13869菌株中，P启动子强度约为IPTG诱导型启动子P的2.2倍；在ATCC 13032菌株中，其强度约为P的0.3倍，其在3株菌中表达LacZ的效果与RFP趋势一致，该启动子的表达强度受菌株影响较大，因此在不同的谷氨酸棒杆菌菌株中使用时需要注意此点。P和P启动子的强度在3株菌中差异较小，约为P的0.1−0.3倍，其受菌株影响较小。根据Shang等[25]建议的内源组成型强启动子标准，将表达强度大于等于P的0.3倍划分为强启动子，而小于0.3倍为弱启动子。由此可见，P为强启动子，P和P为弱启动子。

4 结论

本研究基于谷氨酸高产菌SL4的时间序列转录组数据，从发酵过程均高水平转录的基因筛选内源的组成型强启动子，通过RFP报告系统表征了10个候选启动子，成功获得3个可以通用的组成型启动子P、P和P。其中P的表达强度最高，也可以高效表达LacZ蛋白，该启动子首次被报道为强启动子，可作为高效元件用于谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造。

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Screening efficient constitutive promoters inbased on time-series transcriptome analysis

Yingchun Wang1,2,3, Jiao Liu2,3, Xiaomeng Ni2,3, Yu Lei3, Ping Zheng2,3, and Aipo Diao1

1 School of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China 2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Promoter, an essential regulatory element, is widely used for metabolic engineering of industrial strains.is an important industrial workhorse to produce various amino acids. However, strong constitutive promoters that are applicable toare rarely reported. In this study, we first performed a time-series transcriptome analysis of a glutamate hyper-producingstrainSL4 by using RNA-Seq. Overall, we picked 10 samples at different time during the fermentation process. By analyzing the time-series transcriptome data, we selected 10 candidate genes with the highest transcriptional level. These genes were all transcribed stably during the fermentation process. We subsequently cloned the promoter sequences and evaluated the promoters’ strength in strain SL4 using a red fluorescent protein reporter system. To evaluate the universality of the promoters in differentstrains, we further tested the performance of some promoters in wild typestrains, including ATCC 13869 and ATCC 13032. The strongest promoter was further characterized using LacZ as a reporter in all the threestrains. Finally, we successfully obtained three constitutive promoters with universality, P, Pand P. Pis the most efficient promoter among the threestrains. In strains SL4 and ATCC 13869, the strength of Pis 2-fold of the strong inducible promoter Pusing the red fluorescent protein as a reporter and 4-fold of Pusing LacZ as a reporter. Moreover, the strength of Preaches 30%−40% of Pin strain ATCC 13032. The promoter Pis identified as a strong promoter for the first time, which can be used as an efficient biobrick for metabolic engineering of synthesis pathways in.

, time-series transcriptome, promoter, red fluorescent protein reporter system

January 29, 2018;

April 26, 2018

Tianjin Science and Technology Program (Nos. 15PTCYSY00020, 14ZCZDSY00058), Tianjin Municipal City, the First “Special Support Plan for Talents Development” and “High-level Innovation and Entrepreneurship Team”, National Natural Science Foundation of China (No. 31700044).

Ping Zheng. Tel/Fax: +86-22-84861943; E-mail: zheng_p@tib.cas.cn

Aipo Diao. Tel/Fax: +86-22-60602948; E-mail: diaoaipo@tust.edu.cn

10.13345/j.cjb.180041

天津市科技计划项目 (Nos. 15PTCYSY00020，14ZCZDSY00058)，天津市特支计划高层次创新创业团队，国家自然科学基金 (No. 31700044) 资助。

(本文责编 陈宏宇)