不同杀菌剂对茶云纹叶枯病菌的体外抑制作用和大田防治效果

董照锋，熊潇垚，陈光华

(商洛市农产品质量安全检验检测中心，陕西 商洛 726000)

茶云纹叶枯病(病原ColletotrichumcamelliaeMassee)是茶树主要叶部病害之一，在全世界各产茶区都有发生，属于一种高温高湿性病害[1]。它主要危害老叶和成叶，嫩叶、枝梢、芽叶与果实偶尔也会受害[2]。我国各大茶区均有茶云纹叶枯病的发生，近年来其已经成为茶园主要病害之一，严重影响了茶叶产量和品质，制约了茶产业的健康发展。国内关于茶云纹叶枯病药剂防治的研究较多。胡淑霞等[3]研究结果显示，多抗霉素在稀释500倍时对茶云纹叶枯病的抑菌效果为47%。苏经迁等[4]研究发现，长枝木霉CSN-18和曲霉CSN-3混合培养原液的乙酸乙酯萃取液对茶云纹叶枯病菌菌丝的抑制率为71.51%。王志坤等[5]研究表明，1%武夷菌素水剂600倍田间防效达到71.33%。李正英等[6]试验表明，50%和瑞1 000倍和10%世高1 000倍对茶云纹叶枯病防效分别为94.32%和92.28%。陈晶等[7]研究表明，氧苦内酯和武夷菌素对茶树云纹叶枯病病原菌丝生长的抑制率分别为79.78%和75.90%，半数效应质量浓度(EC50)分别为3.12 mg/L和19.22 mg/L。朱蔚[8]试验发现，当柑橘皮乙醇提取物的石油醚部位质量浓度在0.8 mg/mL时，提取物对茶云纹叶枯病病原菌抑制率高达80.9%，EC50值为0.163 8 mg/mL；当二氯甲烷部位的质量浓度为1.12 mg/mL时，提取物对茶云纹叶枯病病原菌的抑制率则为60.6%，EC50值为0.764 3 mg/mL。通过分析发现，有些农药防效较低，有些农药并未大量生产销售，有些仅是一种农药研制开发的方向。为了筛选安全、高效、环保的防治药剂，以有效控制茶云纹叶枯病危害并满足人们对茶叶安全和品质的高要求，选取生物农药、微生物源农药和化学农药三大类共5种药剂对茶云纹叶枯病病原菌进行室内抑制试验与大田防治试验，以期为茶云纹叶枯病在实际生产中的防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试药剂

2%武夷菌素水剂(AS)：山东潍坊万胜生物农药有限公司；3%多抗霉素水剂：安徽绩溪农华生物科技有限公司；6%春雷霉素可湿性粉剂(WP)：山东利邦农化有限公司；100亿个/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂：黑龙江德强生物股份有限公司；430 g/L戊唑醇悬浮剂(SC)：西安鼎盛生物化工有限公司。试验期间供试药剂均在有效期内。

1.2 供试菌株

2016年10月23日，在商南县试马镇郭家垭村坪地茶园的云纹叶枯病重发田块中，采集具有典型症状的新鲜病叶，经实验室分离鉴定确认得到茶云纹叶枯病病原菌后，接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)试管斜面培养基并置于4 ℃保存。

1.3 试验方法

1.3.1 5种杀菌剂对茶云纹叶枯病菌菌丝生长的抑制作用测定 试验分为6个处理，每种杀菌剂所使用的浓度按照使用说明推荐用量确定。A：2%武夷菌素AS 500倍；B：3%多抗霉素AS 500倍；C：6%春雷霉素WP 600倍；D：100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 600倍；E：430 g/L戊唑醇SC 3 000倍；F：无菌水对照(CK)。每个处理4个重复。采用菌丝生长速率法[9-10]测定5种杀菌剂对菌丝生长的抑制活性。含杀菌剂培养基制备：操作在无菌P2微生物实验室内进行，将杀菌剂用灭菌水稀释至试验设计倍数的10倍，分别盛装在100 mL灭菌广口瓶内并标记处理编号。取5 mL稀释好的杀菌剂注入150 mL灭菌烧杯中，加入经高压蒸气灭菌并冷却到50 ℃左右的PDA培养基45 mL，充分混合均匀后，取10 mL注入9 cm灭菌培养皿中制成含杀菌剂的PDA培养基平板(为防止培养基过快冷凝，确保每个培养皿中所含杀菌剂培养基足量，在实际操作时每个处理一次性多配制10 mL)，以含等量无菌水的培养基作为空白对照。接种：将病原菌接于PDA培养基，置于25 ℃、湿度90%条件下培养5 d进行菌种活化，在菌落周边生长旺盛、一致处用打孔器制作直径6 mm的菌饼，取1块菌丝面朝上植入含杀菌剂的PDA培养基中心。置于25 ℃、湿度90%条件下培养，分别于48、72、96、120 h用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。用SPSS 17.0软件进行方差分析和多重比较(LSD法)。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100%。

1.3.2 5种杀菌剂对茶云纹叶枯病菌分生孢子萌发的抑制作用测定 采用孢子萌发法[11-12]测定5种杀菌剂对分生孢子萌发的抑制作用。试验分为6个处理，同1.3.1。分生孢子悬浮液制备：选取培养7～10 d已产孢的PDA平板，在无菌条件下加入10 mL无菌水，用一次性接种铲轻刮菌落表面，在口径7 cm灭菌小漏斗上放入2层擦镜纸，将分生孢子悬浮液过滤到已灭菌的50 mL锥形瓶内，并加灭菌棉塞。于载玻片上滴1～2滴分生孢子悬浮液，加盖玻片后，在显微镜下观察统计分生孢子数量，将分生孢子浓度调节至每个视野80～100个为宜。含杀菌剂培养基制备及分生孢子接种：分生孢子采用水琼脂培养法[13]，取2 mL稀释好的杀菌剂注入50 mL灭菌烧杯中，再加入经过高压蒸气灭菌并冷却到50 ℃左右的无菌水琼脂培养基18 mL，充分混合均匀后，取10 mL注入9 cm灭菌培养皿中，制成含杀菌剂的水琼脂培养基平板，以含等量无菌水的培养基作为空白对照。在每个培养皿背面用记号笔画3个小圆圈提前标记分生孢子悬浮液的滴入位置以便观察，在每个小圆圈内滴入1滴分生孢子悬浮液，即为3次重复。将各处理培养皿置于25 ℃、湿度90%条件下培养，当对照组分生孢子80%～90%萌发时，先将各处理培养皿置于4 ℃冰箱中，再逐一观察并计算分生孢子萌发率。

分生孢子萌发率=(分生孢子萌发数量/观察分生孢子数量)×100%，

分生孢子萌发抑制率=(对照分生孢子萌发率-处理分生孢子萌发率)/对照分生孢子萌发率×100%。

1.3.3 杀菌剂不同浓度处理的抑菌效果测定 根据1.3.1、1.3.2筛选出抑菌效果较好的杀菌剂，进行浓度梯度试验，测定不同浓度杀菌剂的生物活性。试验方法同上。

1.3.4 杀菌剂联合作用效果测定 根据1.3.1、1.3.2、1.3.3筛选出抑菌效果较好的杀菌剂和使用浓度进行组合，测定杀菌剂联合使用的抑菌作用。试验方法同上。

1.3.5 大田防治试验 试验在商南县试马镇红庙村6年生丰产茶园开展，根据杀菌剂抑菌试验结果，设6个处理，a：6%春雷霉素WP 1 000倍；b：100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍；c：430 g/L戊唑醇SC 5 000倍；d：430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配；e：6%春雷霉素WP 1 000倍与100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍交替使用；f：清水对照(CK)。每个处理4个重复，随机区组设计，小区面积48 m2。喷药器械采用背负式手动喷雾器，共进行2次喷药防治，第1次防治时间为2017年8月16日，第2次防治时间为8月26日。喷施药量为900 kg/hm2，喷施重点为中、上部新生枝叶。调查方法：每个小区于中间2畦茶树，按5点取样法，每点选10个当年新生茶枝，并用编织绳框定标记(每个小区至少有1点新生枝条上有已发病的叶片)，于防治前、第1次防治后10 d及第2次防治后10、20 d调查各小区编织绳框定标记的各点病情。调查每个新生枝条上所有的叶片，记载各枝总叶数、病叶数、严重度，其中茶云纹叶枯病严重度分级标准为：0级，无病斑；1级，病斑占叶面积≤1/4；2级，1/4<病斑占叶面积≤1/2；3级，1/2<病斑占叶面积≤3/4；4级，病斑占叶面积>3/4。最后分别统计各小区调查总叶数、病叶数、病叶率、平均严重度及病情指数。

病情指数=∑(各病级叶片数×该病级数)/(调查总叶片数×最高病级值)×100，

病指减退率=(施药前病指-施药后病指)/施药前病指×100%，

校正防效=(处理区病指减退率-对照区病指减退率)/(1-对照区病指减退率)×100%。

2 结果与分析

2.1 5种杀菌剂对茶云纹叶枯病菌菌丝的抑制作用

表1、图1表明，5种杀菌剂对菌丝生长的抑制效果差异较大，其中戊唑醇抑制效果最好且抑制作用持久，120 h抑制率达100%，其次是枯草芽孢杆菌，抑制效果随着时间延长呈逐渐上升趋势，120 h抑制率达86.57%，春雷霉素、多抗霉素、武夷菌素120 h抑制率分别为53.57%、24.54%、11.11%。春雷霉素在72 h时抑制效果达到最好，为61.09%。120 h时戊唑醇、枯草芽孢杆菌、春雷霉素处理菌落直径均与对照差异极显著。

表1 5种杀菌剂对茶云纹叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

注：以上数据均为4次重复平均值，同列不同字母表示0.01水平差异显著。

图1 120 h时5种杀菌剂对茶云纹叶枯病菌菌丝生长的抑制效果

2.2 5种杀菌剂对茶云纹叶枯病菌分生孢子的抑制作用

表2表明，培养8 h对照组分生孢子萌发率达到81.25%，春雷霉素抑制效果最好，抑制率达100%，多抗霉素抑制率为60.30%，枯草芽孢杆菌、戊唑醇、武夷菌素抑制率分别为34.84%、17.55%、1.71%。春雷霉素与多抗霉素抑制效果明显，两处理的分生孢子萌发率与对照差异极显著。

表2 5种杀菌剂对茶云纹叶枯病菌分生孢子萌发的抑制作用

注：表中数据均为3次重复平均值，同列不同字母表示0.01水平差异显著。

2.3 不同浓度春雷霉素、戊唑醇、枯草芽孢杆菌的抑菌效果

2.3.1 不同浓度春雷霉素对茶云纹叶枯病菌菌丝和分生孢子的抑制作用 表3表明，不同浓度春雷霉素对菌丝生长的抑制效果差异不大。其中稀释400倍抑制效果相对较好，72 h抑制率最高，为61.90%，120 h抑制率为59.28%。120 h时春雷霉素稀释1 200倍、1 000倍、800倍、600倍、400倍对菌落直径的影响差异不显著。表4表明，不同浓度春雷霉素对分生孢子萌发的抑制效果差异不大，其中春雷霉素稀释400倍、600倍、800倍、1 000倍抑制率均为100%，稀释1 200倍抑制率为96.65%。不同浓度春雷霉素之间对分生孢子萌发的影响差异不显著。

表3 不同浓度春雷霉素对茶云纹叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

注：表中数据均为4次重复平均值，同列不同大、小字母分别表示0.01、0.05水平差异显著，表5—7同。

表4 不同浓度春雷霉素对茶云纹叶枯病菌分生孢子萌发的抑制作用

注：表中数据均为3次重复平均值，同列不同大、小字母分别表示0.01、0.05水平差异显著。

2.3.2 不同浓度戊唑醇对茶云纹叶枯病菌菌丝和分生孢子的抑制作用 表5表明，不同浓度戊唑醇对菌丝生长的抑制效果明显、作用持久，120 h时戊唑醇稀释3 000倍、3 500倍、4 000倍、4 500倍抑制率均为100%，稀释5 000倍抑制率为98.35%。5个供试浓度对菌落直径的影响差异不显著。此外，各浓度处理对分生孢子萌发的抑制作用不明显，抑制率为0.75%～9.60%。

表5 不同浓度戊唑醇对茶云纹叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

2.3.3 不同浓度枯草芽孢杆菌对茶云纹叶枯病菌菌丝和分生孢子的抑制作用 表6表明，不同浓度枯草芽孢杆菌对菌丝生长的抑制作用较好，120 h时枯草芽孢杆菌稀释300倍、600倍、900倍、1 200倍、1 500倍对菌丝生长的抑制率分别为86.54%、84.89%、83.85%、83.64%、81.57%。随着时间延长，不同浓度枯草芽孢杆菌的抑制率均呈递增趋势，在120 h达到最大。此时，枯草芽孢杆菌稀释300倍与1 500倍对菌落直径的影响差异极显著，其他浓度之间影响差异不显著。此外，各浓度处理对分生孢子萌发的抑制效果较差，抑制率为7.31%～31.15%。

表6 不同浓度枯草芽孢杆菌对茶云纹叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

2.4 杀菌剂的联合抑菌效果

根据5种杀菌剂对菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用结果，选择430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配、100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配对菌丝生长和分生孢子萌发进行抑制作用测定。表 7、表8表明，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配对菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果都很明显，抑制率均达到100%，且抑制作用持久。100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配对菌丝生长抑制作用较差(38.60%)，混配降低了枯草芽孢杆菌对菌丝生长的抑制作用，但对分生孢子萌发的抑制作用依然很好，抑制率达到100%。

表7 组合杀菌剂对茶云纹叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

表8 组合杀菌剂对茶云纹叶枯病菌分生孢子萌发的抑制作用

2.5 大田防治试验结果

大田试验结果表明(表9)，5个药剂处理对茶云纹叶枯病都有较好的防治效果。第1次防治后10 d调查发现，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍防效最好，达到77.23%，其他4种药剂处理的防效在61.15%～69.90%。第2次防治后10 d调查发现，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍防效为80.20%，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配、6%春雷霉素WP 1 000倍与100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍交替使用、6%春雷霉素WP 1 000倍、100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍4个药剂处理的防效分别为74.87%、73.55%、70.94%、66.12%。第2次防治后20 d调查，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配防效最好，达到78.81%，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍、6%春雷霉素WP 1 000倍与100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍交替使用、6%春雷霉素WP 1 000倍、100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍4个药剂处理的防效分别为77.90%、77.66%、74.69%、68.13%。第2次防治后20 d，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配、430 g/L戊唑醇SC 5 000倍、6%春雷霉素WP 1 000倍与100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍交替使用3个药剂处理的防效差异不显著，而与6%春雷霉素WP 1 000倍、100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍处理差异显著。

表9 不同处理对茶云纹叶枯病的大田防治效果

注：表中数据为4次重复均值，不同字母表示0.05水平差异显著。

3 结论与讨论

茶云纹叶枯病病原菌抑制试验结果表明，戊唑醇、枯草芽孢杆菌对菌丝抑制作用较强且持久，春雷霉素对分生孢子抑制效果最好，对菌丝也有一定的抑制效果。120 h时戊唑醇稀释3 000倍、3 500倍、4 000倍、4 500倍对菌丝生长的抑制率均为100%，稀释5 000倍对菌丝生长的抑制率为98.35%，5个供试浓度对菌丝生长的抑制效果差异不显著。120 h时枯草芽孢杆菌稀释300倍、600倍、900倍、1 200倍、1 500倍对菌丝生长的抑制率分别为86.54%、84.89%、83.85%、83.64%、81.57%，稀释300倍与1 500倍抑制率差异极显著，其他浓度之间抑制率差异不显著。春雷霉素稀释400倍、600倍、800倍、1 000倍对分生孢子萌发的抑制率均为100%，稀释1 200倍时抑制效果为96.65%，不同浓度之间的抑制效果差异不显著。大田防治试验结果表明，430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配、430 g/L戊唑醇SC 5 000倍、6%春雷霉素WP 1 000倍与100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍交替使用、6%春雷霉素WP 1 000倍、100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍的防效分别为78.81%、77.90%、77.66%、74.69%、68.13%。根据病原菌抑制试验和大田防治试验结果，结合防治效果、成本和安全性综合分析认为，生产中可采用430 g/L戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍混配，或者6%春雷霉素WP 1 000倍与100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍交替使用2个配方防治茶云纹叶枯病。特别是有机、绿色茶园，建议采用6%春雷霉素WP 1 000倍与100亿个/g枯草芽孢杆菌WP 1 000倍，间隔10～15 d交替喷雾1次。

本研究在室内开展大量杀菌剂抑菌试验的基础上，筛选出戊唑醇、春雷霉素、枯草芽孢杆菌3种不同类型的高效杀菌剂后，开展防治茶云纹叶枯病的大田试验，获得了有效的防治方案。本试验对茶云纹叶枯病防治的研究比较系统，对指导该病防治有重要现实意义，特别是前人关于使用枯草芽孢杆菌和戊唑醇防治该病的研究极少。试验结果显示，武夷菌素和多抗霉素对茶云纹叶枯病病原菌的抑制作用较差，与早期王志坤等[5]、胡淑霞等[3]研究结果差异较大，推测其原因可能与试验方法、环境条件、培养时长等因素有关，同时也可能与病原菌本身的抗药性有关。在试验过程中还发现，枯草芽孢杆菌和多抗霉素对茶云纹叶枯病菌分生孢子有致畸作用，畸形率分别达到19.08%和16.13%，主要表现为孢子芽管显著缩短，部分孢子芽管畸形、局部膨大，萌发明显受阻。培养24 h和48 h观察发现，畸形芽管可以继续生长，但生长速度明显缓慢，至于能否侵染茶树有待深入研究。