昭通青花椒总生物碱含量测定

熊汝琴，李才涛

（昭通学院 化学化工学院，云南 昭通 657000）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）为芸香科花椒属植物的果皮，不仅是常用调味品之一，而且具有芳香健胃、温中散寒、除湿止痛、杀虫解毒、止痒解腥等药效。目前，国内外学者对花椒化学成分及药理活性研究已十分成熟，研究表明花椒中主要含有挥发油、酰胺、生物碱、黄酮、多酚、香豆素、木脂素等多种化学成分[1-2]。其中生物碱是花椒中普遍存在的一类活性成分，迄今为止，从花椒中已分离得到二十余种生物碱，如青花椒碱、茵芋碱、白藓碱、喹诺酮喹啉生物碱、γ-花椒碱、铁屎米-6-酮、白屈菜红碱等[3-5]。药理研究表明，花椒总生物碱具有较宽的抗菌谱，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和酿酒酵母均有抑制作用，还具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗疟疾、抑制血小板凝集等作用[5-7]，是反映花椒内在品质的主要指标。

花椒是经济价值、药用价值和生态价值较高的农产品，在我国栽培历史悠久，分布范围广泛，昭通地区的产量约占全省的60～70%。昭通市花椒品种有“大红袍”和青花椒两种，其中青花椒人工种植规模较大，主要分布在永善县、鲁甸县、彝良县、巧家县、盐津县、大关县等地区。近年来随着国家提倡振兴特色农业发展，昭通市各级政府高度重视青花椒产业发展，引进新技术发展地方特色农业，青花椒作为地方经济产业支柱，种植规模不断扩大。目前，昭通市花椒产值达 10多亿元，昭通已经成为国内三大青花椒集散地之一。

目前，对花椒生物碱的研究报道主要集中于四川、重庆、陕西等地区所产花椒[8-9]，但是，由于各地地域不同导致的气候、雨量、日照和土质等很多自然因素存在很大差异，不同产地花椒生物碱含量有很大差异。而昭通青花椒的种植面积虽不断扩大，但对其生物碱含量的系统研究却鲜有报道，缺乏理论数据的支撑，加上临近四川、重庆等花椒种植基地，使得昭通青花椒的市场竞争力较弱，品牌效应不高。本次研究将对昭通地区鲁甸县、彝良县、永善县、大关县、盐津县、巧家县六个青花椒主要种植县所产青花椒生物碱进行提取测定，分析昭通地区不同海拔高度及地理环境所产青花椒的生物碱含量，并与其它产地青花椒进行对比，期望为昭通青花椒的质量评价提供基础数据，增加花椒用途，提升价格，带动花椒产区经济发展。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；先行者电子分析天平；XFB-200家用粉碎机（吉首市中湘制药机械厂）；PHS-3C型数显酸度计（潍坊金水华禹信息科技有限公司）；HH-S型恒温水浴锅；UNIC7200可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；移液枪。

1.2 材料与试剂：

青花椒样品分别采于昭通市鲁甸县梭山镇，巧家县大寨乡，彝良县角奎镇，永善县黄华镇、盐津县庙坝镇、大关县高桥镇。白屈菜红碱标准品（江苏永健医药科技有限公司）；碘化铋钾；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；无水乙醇；氯仿（均为分析纯）。

2 实验方法

2.1 试液配制

2.1.1 pH值=7.6的溴甲酚绿磷酸缓冲液的配制

准确称取Na2HPO417.90g，溶解定容至250mL容量瓶中，其浓度为0.2mol/L，准确称取NaH2PO41.56g，溶解定容至50mL容量瓶中，其浓度为0.2mol/L。分别取NaH2PO4溶液87mL，NaH2PO4溶液13mL，称取0.05g溴甲酚绿定容至100mL；即配制成pH值=7.6的溴甲酚绿磷酸缓冲液。

2.1.2 碘化铋钾溶液的配制

准确称取碘化铋钾2.00g，加入20mL冰醋酸充分溶解后加入50mL水稀释即可。

2.1.3 标准溶液的配制

准确称取5.00mg白屈菜红碱标准品，加无水乙醇定容至25mL，制得0.2mg/mL白屈菜红碱标准溶液。

2.2 标准曲线的建立

准确吸取取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL白屈菜红碱标准溶液于5支规格为25mL的试管中，先加入一定量蒸馏水补至5mL，再加入2mL溴甲酚绿磷酸缓冲液，最后加氯仿10mL。振荡2分钟后，分别倒入干燥洁净的分液漏斗中充分摇匀后静置1小时。待溶液分层后，取氯仿层(下层)在425nm波长下测定吸光度值，建立标准曲线[10]。

2.3 样品处理

将昭通六县区所产青花椒果皮干至恒重，分别用粉碎机粉碎后过60目筛，精确称取5.0g粉末倒入具塞锥形瓶中，平行称三份，加70%乙醇溶液75mL，用稀盐酸溶液调节pH=3，室温浸提5小时后过滤。用浓氨水将滤液调节至中性，分别取5mL滤液于5支试管中，再分别加入2mL溴甲酚绿磷酸缓冲液和10mL氯仿，振荡2分钟后，倒入分液漏斗中充分摇匀静置1小时。取分液漏斗上层液1mL，加入1mL碘化铋钾溶液，若有橘红色沉淀生成则继续加氯仿至生物碱萃取完全，取氯仿层在425nm波长处测吸光度[11-12]。

3 结果与分析

3.1 标准曲线方程

以白屈菜红碱质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为y= 4.615x + 0.0044，线性相关系数r=0.9994，说明白屈菜红碱质量浓度在0～0.2 mg/mL与吸光度呈良好的线性关系，该方程可用于青花椒总生物碱含量测定。

图1 生物碱测定标准曲线

3.2 稳定性实验

取制备好的供试溶液，按前述2.2测定方法，在样品液与显色剂反应完全后，分别在0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h连续测定吸光度，所测吸光度值的相对标准偏差RSD为1.56%，说明显色后的溶液在3.0h内稳定。

3.3 精密度实验

取制备好的供试溶液，按前述2.2测定方法，重复测定5次，记录吸光度值，相对标准偏差RSD为0.32%，表明仪器精密度高。

3.4 重现性实验

分别称取鲁甸县所产青花椒样品粉末5份，每份5.0g，按2.3项方法处理后获得供试溶液，再按2.2项方法测定吸光度值，相对标准偏差RSD为1.35%，表明重复性高。

3.5 昭通青花椒总生物碱含量

分别称取昭通六县区所产青花椒干燥果皮粉末5.0g，按前述方法提取其中总生物碱制备待测溶液，采用酸性染料比色法测定吸光度值，并根据标准曲线计算总生物碱含量，结果见表1。

表1 昭通六县区青花椒生物碱含量

从表中可见，昭通地区六县所产青花椒中总生物碱含量在0.343%～0.430%之间，没有显著差异。

4 小结与讨论

本文以白屈菜红碱为标准品绘制标准曲线。根据生物碱可与酸反应生成盐，使其在乙醇中的溶解度增大，用70%乙醇溶液并加稀盐酸调节pH为酸性，充分浸提过滤后，用浓氨水将滤液调节至中性，氯仿萃取生物碱后加溴甲酚绿磷酸缓冲液显色，于425nm波长处测吸光度。实验结果表明，昭通市六县区所产青花椒中总生物碱含量在0.343%～0.430%之间，没有显著差异，本文为昭通青花椒的进一步开发利用提供理论依据。