植物乳杆菌发酵苦荞芽苗茶饮料加工工艺研究

李 俊， 刘 辉， 刘永翔， 王 辉， 刘 嘉， 卢 扬

(贵州省农业科学院 食品加工研究所/贵州省薯类工程研究中心， 贵州 贵阳 550006)

苦荞是一种重要的小宗杂粮作物和药食同源植物，富含芦丁(即维生素P)、槲皮素等黄酮类物质，营养素含量丰富，比例均衡[1-2]。苦荞籽粒中含有高活性的胰蛋白酶抑制剂，使荞麦蛋白的消化吸收率远低于小麦和豆类，过量食用还会引起腹胀等不适症状[3]。有研究发现，苦荞麦经过萌发后理化性质发生较大变化，营养价值大幅提高。如苦荞籽粒萌发后，氨基酸更为均衡，黄酮类物质的含量有明显提高，芦丁含量较籽粒增加4～6倍[4-6]。目前，国内外对苦荞产品的开发主要集中于苦荞籽粒[7-8]，产品形式多样，但对苦荞萌发后的芽苗研究还较少。

发酵茶饮料是以茶水为主要基质，通过微生物的代谢作用使茶水发生深度的良性生理生化变化。茶水经微生物发酵后，可以增加微生物代谢活性物质及微生物菌体本身等多种有益成分，品质得到改善[9-11]。目前，国内外已经有诸多利用乳酸菌发酵开发功能饮料的报道，Cho等[12]和Sorbhi等[13]开发出的乳酸菌发酵饮料蛋白含量高、活菌数高、脂肪含量低，抗氧化及抗菌活性显著增强，感官性状良好。陈康等[14]研究了植物乳杆菌PMO发酵金银花凉茶，发现PMO经过驯化，在金银花凉茶中具有优良的增殖活性。现阶段苦荞茶制品存在产品种类及口感单一的问题，因此，本研究拟采用萌发后的苦荞芽苗和苦荞茶作为发酵原料，通过植物乳杆菌进行发酵，优化发酵工艺和产品配方。希望得到发酵苦荞芽苗茶饮料的优化加工技术，并研制出一种营养丰富的苦荞芽苗发酵茶饮料，丰富苦荞制品品类，提高苦荞的利用率。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

苦荞籽粒(贵米苦18号)由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供，在25 ℃、相对湿度80%条件下萌发8～10 d，制取萌发苦荞芽苗；苦荞茶由贵州省威宁县东方神谷有限责任公司提供；植物乳杆菌购于广东省微生物菌种保藏中心；芦丁标准品，美国Sigma公司；果葡糖浆、黄原胶、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、海藻酸钠均为食品级；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯；所用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

JYL- Y92型高速破壁调理机，九阳股份有限公司；BRS- 200型均质机，安徽博进化工机械有限公司；YXQ- LS型立式压力蒸汽灭菌器、HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司；CP213型分析天平，奥豪斯仪器有限公司；UV- 2102C型紫外可见分光光度计，尤尼科上海仪器有限公司；PHS- 2F型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1苦荞芽苗茶饮料加工工艺流程

苦荞茶与苦荞芽苗按比例混匀后打浆，用4层纱布过滤杂质后，在4 000 r/min条件下离心5 min；按比例加入纯净水进行稀释，然后添加果葡糖浆、黄原胶、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、海藻酸钠，均质后在121 ℃条件下灭菌5 min，接种乳酸菌发酵，无菌灌装，即为苦荞芽苗活菌饮料。苦荞芽苗茶饮料加工工艺流程见图1。

图1 苦荞芽苗茶饮料加工工艺流程Fig.1 Flow diagram of tea beverage of tartary buckwheat seedlings processing

1.3.2苦荞芽苗及苦荞茶中加水量的确定

控制苦荞茶质量为50 g，按照质量比1∶30比例加入纯净水煮沸5 min，制成苦荞茶汁，冷却备用。控制苦荞芽苗质量为200 g，按照苦荞茶汁与苦荞芽苗质量比分别为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1的比例添加，加入匀浆机中打浆，用纱布过滤，8 000 r/min离心5 min，取上清液用纯净水稀释至8 000 mL；加入质量分数为4%的果葡糖浆，0.05%的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、0.05%的海藻酸钠、0.05%的黄原胶，均质5 min，在121 ℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌5 min，冷却后进行感官评定，并测定总黄酮含量。

根据实验测得的苦荞芽苗与苦荞茶汁较佳比例，将离心后的上清液按照纯净水与上清液体积比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的比例稀释，然后同上处理。

1.3.3苦荞芽苗茶饮料发酵工艺条件优化

1.3.3.1 发酵工艺条件的单因素实验

按照1.3.2中的步骤操作，灭菌后进行发酵实验。分别设定菌剂接种量(质量分数)为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，发酵时间为0、6、12、18、24、36、48 h，果葡糖浆添加量为0、2%、4%、6%、8%、10%[15]，考察不同因素对发酵效果的影响。以发酵后苦荞芽苗茶饮料的感官评分和pH值为评价指标评价发酵效果。

1.3.3.2 发酵工艺条件的响应面优化试验

在单因素实验的基础上，对苦荞芽苗茶饮料感官品质有影响的3个因素：菌剂接种量、发酵时间和果葡糖浆添加量，进行响应面优化试验，筛选出优化的发酵工艺条件。

1.3.4苦荞芽苗茶饮料稳定性实验

1.3.4.1 稳定剂添加量的单因素实验

参照文献[16-17]并按照1.3.2中的步骤操作，分别设定黄原胶添加量为0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%，CMC-Na添加量为0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%，海藻酸钠添加量为0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，灭菌后进行发酵；考察不同稳定剂对苦荞芽苗茶饮料品质的影响，以感官评分和透光率为评价指标评价稳定剂的效果。

1.3.4.2 稳定剂添加量的响应面优化试验

在单因素实验的基础上，对苦荞芽苗茶饮料感官品质有影响的3个因素：黄原胶添加量、CMC-Na添加量和海藻酸钠添加量，进行响应面优化试验，筛选出优化的稳定剂配比。

1.3.5分析方法

pH值测定：采用pH计测定。

总黄酮含量测定：铝盐比色法测定[18]，绘制的芦丁标准曲线方程为y=0.318 6x+0.002，R2=0.999 1。

透光率测定：采用紫外可见分光光度计，在680 nm下进行测定[19]。

1.3.6感官评定标准

参考文献[20]，邀请10位经过培训的感官检验员，参照表1对苦荞芽苗茶饮料外观、色泽、风味和口感进行感官评分，实验重复3次，取平均值。以静态感官评定法(DSA)判定产品效果。

表1 苦荞芽苗茶饮料感官评价指标

1.4 数据处理

采用Origin(Version 8.6)绘图，采用SPSS(Version 17.0)进行统计学分析，p<0.05认为有统计学显著性差异，p<0.01认为有统计学极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 苦荞芽苗及苦荞茶中加水量的确定

苦荞茶汁和纯净水添加量对苦荞芽苗茶饮料感官评分和总黄酮含量的影响见图2。由图2a可知，随着苦荞茶汁与苦荞芽苗比例逐渐上升，感官评分和总黄酮含量都逐渐增加，当苦荞芽苗与苦荞茶汁质量比为1∶6时，感官评分达到最大值，总黄酮质量浓度也达到0.25 mg/mL；可能是因为随着苦荞茶汁加入量的增多，苦荞芽苗中提取出的总黄酮含量增多；随着二者比例继续增加，感官评分和总黄酮含量都基本保持不变，因此，较优的苦荞芽苗与苦荞茶汁质量比为1∶6。由图2b可知，随着稀释比例的增加，感官评分在稀释比例为10倍时达到最大值；随着稀释比例升高，感官评分有显著降低趋势。总黄酮含量随着稀释比例升高显著降低，因为提取出的苦荞芽苗中总黄酮含量一定，稀释比例越高，最终产品中总黄酮含量越低。因此，较优的上清液稀释比例为1∶10。在较优的稀释比例条件下，产品的总黄酮含量可达(0.193±0.006)mg/mL。

2.2 发酵工艺条件的确定

2.2.1单因素实验结果

发酵条件对苦荞芽苗茶饮料感官评分和pH值的影响见图3。由图3a可知，随着菌剂接种量的增加，感官评分先升高后显著降低，在菌剂接种量为0.6%时达到最大值，而pH值随着菌剂接种量的增加呈显著下降趋势。因为植物乳杆菌会发酵饮料中的糖分产生乳酸，当菌剂接种量增大时，乳酸产量也随之增多，导致产品酸度升高，浓度过高时导致产品感官品质下降[21]，因此，较优的菌剂接种量为0.6%。由图3b可知，发酵时间增加，感官评分先升高后降低，pH值呈显著下降趋势，原因也是由于乳酸含量升高，因此，较优的发酵时间为24 h。由图3c可知，果葡糖浆添加量增加，感官评分先升高后缓慢降低，可能是因为随着果葡糖浆添加量增加，植物乳杆菌发酵产生的乳酸含量增加，同时产品甜度上升，感官评分不断升高；当果葡糖浆添加量超过6%时，由于菌剂接种量和发酵时间一定，此时乳酸生成量趋于饱和，产品甜度上升，导致感官评分下降。pH值随着果葡糖浆添加量升高呈显著降低趋势。因此，较优的果葡糖浆添加量为6%。

图中不同数字和字母表示差异显著(p<0.05)。图2 苦荞茶汁和纯净水添加量对苦荞芽苗茶饮料感官评分和总黄酮含量的影响Fig.2 Effects of tartary buckwheat juice and water addition amounts on sensory quality and total flavonoids content of tea beverage of tartary buckwheat seedlings

图中不同数字和字母表示差异显著(p<0.05)。图3 不同发酵条件对苦荞芽苗茶饮料感官评分和pH值的影响Fig.3 Effects of different fermentation conditions on sensory quality and pH of tea beverage of tartary buckwheat seedlings

2.2.2发酵工艺条件的响应面优化试验结果

2.2.2.1 Box-Behnken设计与结果

根据单因素实验结果，以 Box-Behnken 中心组合设计原则，选取菌剂接种量(A)、发酵时间(B)、果葡糖浆添加量(C)为自变量，以感官评分为响应值，设计三因素三水平响应面试验，试验方案及试验结果如表2。

2.2.2.2 回归方程与显著性分析

将表2的试验数据，利用Design-Expert 8.0软件进行二次多项式逐步回归拟合，得回归模型方程见式(1)。

Y=89.37-0.19A-1.52B+0.72C+0.16AB-
0.30AC-3.39BC-1.01A2-5.94B2-3.26C2。

(1)

模型的可靠性可以从方差分析及相关系数来考察，结果见表3。

表2 发酵工艺条件Box-Benhnken试验方案及试验结果

表3 发酵工艺条件回归模型方差分析

*为显著(p< 0.05),**为极显著(p< 0.01)。

由表3可知，模型F=261.20，所得发酵工艺条件的回归方程极显著(p< 0.000 1)；F失拟=4.70，失拟项不显著(p>0.05)，可以对发酵工艺条件进行准确预测和分析。R2=99.70%，说明响应值(感官评分)的变化有99.70%来源于菌剂添加量、发酵时间和果葡糖浆添加量。方差分析结果表明：一次项和二次项都有显著性因素，其中B，C，BC，A2，B2，C2显著，各试验因子对感官评分具有交互影响的非线性关系。可以利用回归方程确定优化发酵工艺条件，3个变量对感官评分的贡献大小为B>C>A。

2.2.2.3 响应面分析

菌剂添加量A的水平固定为0.6%时，果葡糖浆添加量和发酵时间对感官评分的影响见图4。由图4可知，无论果葡糖浆添加量处于何种水平，随着发酵时间延长，感官评分均先升高后缓慢降低。由于发酵时间越长，乳酸菌从调整期进入对数生长期[22]，产酸量逐渐增多，产品的最适pH值为3.87±0.05，低于最适pH值产品的感官评分降低。由方差分析可知，两者对感官评分影响显著，与其相对应的等高线形状为椭圆形，表明果葡糖浆添加量和发酵时间交互作用显著。

图4 果葡糖浆添加量和发酵时间对苦荞芽 苗茶饮料感官评分的影响Fig.4 Effects of dosage of fructose-glucose syrup and fermentation time on sensory quality of tea beverage of tartary buckwheat seedlings

根据回归模拟方程，得到优化发酵工艺条件为：菌剂添加量0.6%，发酵时间24 h，果葡糖浆添加量6%，在该条件下进行感官评定；感官评分的平均值达91.50±0.29，测定pH值为3.87±0.05。该模型可以很好地反映优化的发酵工艺条件。

2.3 稳定剂添加量的确定

2.3.1单因素实验结果

稳定剂添加量对苦荞芽苗茶饮料感官评分和透光率的影响见图5。由图5a可知，随着黄原胶添加量的增加，感官评分先显著升高后显著降低，在黄原胶添加量为0.06%时达到最大值，而透光率随着黄原胶添加量的增加保持缓慢上升。因此，较优的黄原胶添加量为0.06%。由图5b可知，CMC-Na添加量增加，感官评分在添加量为0.08%时达到最大值，之后开始降低。透光率随着添加量增加呈缓慢升高趋势，因此，较优的CMC-Na添加量为0.08%。由图5c可知，海藻酸钠添加量增加，感官评分先升高后趋于稳定，而透光率随着海藻酸钠添加量升高先显著升高后基本保持不变。因此，较优的海藻酸钠添加量为0.05%。

图中不同数字和字母表示差异显著(p<0.05)。图5 不同稳定剂添加量对苦荞芽苗茶饮料感官评分和透光率的影响Fig.5 Effects of different dosages of stabilizer on sensory quality and light transmittance of tea beverage of tartary buckwheat seedlings

2.3.2稳定剂配方的响应面优化试验结果

2.3.2.1 Box-Behnken设计与结果

根据单因素实验结果，以 Box-Behnken 中心组合设计原则，选取黄原胶添加量(A)、CMC-Na添加量(B)、海藻酸钠添加量(C)为自变量，以感官评分为响应值，设计三因素三水平响应面试验，试验方案及试验结果如表4。

2.3.2.2 回归方程与显著性分析

将表4的试验数据，利用Design-Expert 8.0软件进行二次多项式逐步回归拟合，得回归模型方程见式(2)。

Y=91.62+1.19A+0.29B+1.80C-1.15AB+
0.12AC-0.48BC-2.86A2-1.51B2-2.48C2。

(2)

模型的可靠性可以从方差分析及相关系数来考察，结果见表5。

由表5可知，模型F=24.55，所得稳定剂配方的回归方程极显著(p<0.000 1)；F失拟=3.87，失拟项不显著(p>0.05)，可以对稳定剂配方进行准确预测和分析。R2=96.93%，说明响应值(感官评分)的变化有96.93%来源于黄原胶添加量、CMC-Na添加量和海藻酸钠添加量。方差分析结果表明：一次项和二次项都有显著性因素，其中A，C，AB，A2，B2，C2显著，各试验因子对感官评分具有交互影响的非线性关系。可以利用回归方程确定优化稳定剂配方，3个变量对感官评分的贡献大小为C>A>B。

表4 稳定剂配方Box-Benhnken试验方案及试验结果

表5 稳定剂配方回归模型方差分析

*为显著(p< 0.05),**为极显著(p< 0.01)。

2.3.2.3 响应面分析

海藻酸钠添加量C的水平固定为0.05%时，黄原胶添加量和CMC-Na添加量对感官评分的影响见图6。由图6可知，无论CMC-Na添加量处于何种水平，随着黄原胶添加量升高，感官评分均先升高后缓慢降低。由方差分析可知，两者对感官评分影响显著，与其相对应的等高线形状为椭圆形，表明CMC-Na添加量和黄原胶添加量交互作用显著。根据回归模拟方程，得到稳定剂优化配方为：黄原胶添加量0.06%，CMC-Na添加量0.08%，海藻酸钠添加量0.05%。在该条件下进行感官评定，感官评分的平均值达93.60±0.32，测定透光率为91.37%±0.45%，因此该模型可以很好地反映优化的稳定剂配方。

图6 黄原胶添加量和CMC-Na添加量对苦荞芽苗茶饮料感官评分的影响Fig.6 Effects of dosages of xanthan gum and CMC-Na on sensory quality of tea beverage of tartary buckwheat seedlings

3 结 论

采用植物乳杆菌对苦荞芽苗和苦荞茶汁进行发酵，通过实验初步得到发酵苦荞芽苗茶饮料的加工工艺。实验结果显示，较优的苦荞芽苗与苦荞茶汁比例为1∶6，较优的上清液稀释比例为1∶10，产品的总黄酮含量可达(0.193±0.006)mg/mL。对发酵工艺条件进行响应面优化试验得到优化工艺条件为：菌剂添加量0.6%，发酵时间24 h，果葡糖浆添加量6%。该条件下感官评分的平均值达91.50±0.29，较适的pH值为3.87±0.05。对稳定剂配方进行响应面优化试验得到优化的稳定剂配方为：黄原胶添加量0.06%，CMC-Na添加量0.08%，海藻酸钠添加量0.05%，在该条件下感官评分的平均值达93.60±0.32，透光率为91.37%±0.45%。开发的苦荞芽苗茶饮料口感较好，富含黄酮和益生菌等有益成分，澄清透明、风味独特。本研究可为苦荞的增值利用提供新的途径，为苦荞产品开发提供新的思路，希望为后期进一步研究发酵对苦荞饮料中营养成分的变化提供技术支持。