外源性果胶甲酯酶对低盐腌渍黄瓜质构性质的影响

李 晓， 王文亮， 王月明， 崔文甲,*， 刘丽娜， 徐志祥

(1.山东省农业科学院 农产品研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业部新食资源加工重点实验室， 山东 济南 250100；2.山东农业大学 食品科学与工程学院， 山东 泰安 271018)

黄瓜因其质地脆嫩、风味清香、可直接生食等特点深受消费者的喜爱[1]。长期或过量食用高盐腌渍黄瓜，严重威胁着人们的身体健康，低盐腌渍与高盐腌渍相比更加营养健康。一般认为腌渍蔬菜含盐量低于8%为低盐含量[2]，低盐腌渍由于含盐量不足，导致黄瓜品质下降，失去黄瓜原有的口感与风味。有些学者利用一种或几种金属离子进行腌渍菜的保脆，在一定程度上起到了作用[3-6]。

果蔬硬度主要受果蔬中果胶物质的影响[7]。果胶甲酯酶对果胶具有去甲酯化作用[8]，果胶按照酯化度分为高甲氧基果胶(HM, 基本与Ca2+不发生反应)和低甲氧基果胶(LM, 能与Ca2+形成凝胶)，果胶甲酯酶可将高甲氧基果胶转化成低甲氧基果胶[9]，低甲氧基果胶与Ca2+发生交联作用，得到Ca2+凝胶，形成一个坚固的果胶酸钙网络，防止果胶物质溶出，从而提高果蔬的品质[10-11]。Ando等[12]也证实了这一结论。有研究发现，甜橙果实中果胶甲酯酶(PG)活性增加，导致果实软化程度降低[13]；杜小琴等[14-16]发现低温漂烫激活萝卜中果胶甲酯酶，萝卜泡菜的脆度得到了提高；陆胜民等[17]发现梅果实软化过程中多聚半乳糖醛酸酶含量上升、活性增强；杨林等[18]探讨了果胶甲酯酶和外源Ca2+对番茄丁硬度的影响，实验表明果胶甲酯酶结合氯化钙对番茄丁硬化效果明显；Anthon等[19]也发现了果胶甲酯酶在改善白萝卜泡菜脆度方面具有良好效果。文章通过添加外源性果胶甲酯酶处理低盐腌渍黄瓜达到保脆目的，为果胶甲酯酶改善低盐腌渍蔬菜质构的应用提供了一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜黄瓜，市售；果胶甲酯酶(50 mL)，美国Sigma公司；食盐(食品级)，山东肥城精制盐厂；乳酸钙(食品级)，山东优索化工科技有限公司；硫酸(分析纯)，莱阳经济技术开发区精细化工厂；无水乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；咔唑(化学级)，天津市光复精细化工研究所；半乳糖醛酸(分析纯)，北京Solarbio科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GZX- 9240MBE型电热鼓风干燥箱、SHZ- A型水浴恒温振荡器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；TA.XT Plus型食品质构仪，英国Stable Micro Systems公司；H.H.S6型数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；UV- 6100型紫外可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；数显搅拌器，德国IKA公司；离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品的制备

将新鲜的黄瓜清洗，切成规格为5 cm×1 cm×1 cm的块状，用电热鼓风干燥箱在40 ℃下烘干2 h，使黄瓜表面脱水。将制备好的黄瓜称重160 g放入装有质量分数7%食盐水的500 mL锥形瓶中进行腌渍，料液比为1∶2，并放入恒温恒湿培养箱中，使培养箱中环境保持温度15 ℃、湿度30%。

1.3.2全质构分析

以经过不同处理的黄瓜为研究对象，利用质构仪进行全质构分析(TPA)检测[20]。质构仪质地多面分析方法是模拟人牙齿咀嚼食物，对试样进行2次压缩的机械过程，即利用力学测试方法来模拟人的口腔运动[21]。该测定可综合评价食品的质地特性，减少了感官评价中主观因素带来的评价误差。采用P5平底圆柱探头，触发力5 N，测前速度1mm/s，测中速度0.5 mm/s，测后速度1 mm/s，试样压缩形变50%，2次压缩停顿3 s，随机取5个样品进行测试，取平均值。

1.3.3单因素实验设计

实验考察乳酸钙添加量、果胶甲酯酶添加量、果胶甲酯酶作用温度及作用时间对低盐腌渍黄瓜硬度的影响。

1.3.3.1 乳酸钙添加量的测定

保持温度50 ℃，果胶甲酯酶添加量为0.60%不变，处理时间为20 min。实验设定7个乳酸钙添加量0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 g/mL，测定腌渍黄瓜硬度以确定乳酸钙添加量的合适范围。

1.3.3.2 果胶甲酯酶添加量的测定

保持温度50 ℃，乳酸钙添加量为0.40 g/mL不变，处理时间为20 min。实验设定5个果胶甲酯酶添加量(体积分数)0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%，测定腌渍黄瓜硬度以确定果胶甲酯酶添加量的合适范围。

1.3.3.3 果胶甲酯酶作用温度的测定

保持果胶甲酯酶添加量为0.60%，乳酸钙添加量为0.40 g/mL不变，处理时间为20 min。实验设定5个果胶甲酯酶作用温度20、30、40、50、60 ℃，测定腌渍黄瓜硬度以确定果胶甲酯酶作用温度的合适范围。

1.3.3.4 果胶甲酯酶作用时间的测定

保持果胶甲酯酶添加量为0.60%，乳酸钙添加量为0.40 g/mL不变，处理温度为50 ℃。实验设定5个果胶甲酯酶作用时间10、20、30、40、50 min，测定腌渍黄瓜硬度以确定果胶甲酯酶作用时间的合适范围。

1.3.4正交试验设计

以不同乳酸钙添加量、果胶甲酯酶添加量、果胶甲酯酶作用温度和作用时间为考察因素，黄瓜全质构分析为主要指标，采用四因素三水平正交试验确定外源性果胶甲酯酶优化作用条件，因素水平见表1。

表1 果胶甲酯酶优化作用条件正交试验因素水平表

1.3.5黄瓜中果胶含量的测定

采用咔唑比色法测定[22]。将用酶处理好的黄瓜取出后放入干燥锥形瓶中，在80 ℃杀菌20 min，待样品冷却后，测定其质构和果胶含量。用无水乙醇沉淀试样中的果胶，果胶经水解后生成半乳糖醛酸，在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，该化合物在525 nm处有最大吸收，其吸收值与果胶含量成正比，以半乳糖醛酸为标准物质，标准曲线法定量。

半乳糖醛酸标准曲线的绘制：分别配置半乳糖醛酸标准使用液，质量浓度为0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 mg/L，用分光光度计测定标准使用液的吸光度，制成半乳糖醛酸标准曲线(见图1)，R2=0.997 8，线性关系良好，数据可用。

图1 半乳糖醛酸标准曲线Fig.1 Standard curve of galacturonic acid

1.3.6数据处理

数据用“平均值±标准误”表示，数据处理与分析都用SPSS进行邓肯分析，p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸钙添加比例的确定

低盐黄瓜的硬度随着乳酸钙添加量的增大而先增大后减小，见图2。在乳酸钙添加量达到0.40g/mL时，低盐黄瓜的硬度最大，达到2 760 g左右；后继续增加乳酸钙添加量，低盐黄瓜硬度有下降的趋势。因此从节约成本的角度考虑，乳酸钙的较优添加量为0.40 g/mL。

图2 乳酸钙添加量对低盐黄瓜硬度的影响Fig.2 Effect of calcium lactate amounts on hardness of low-salt cucumber

2.2 果胶甲酯酶添加比例的确定

随着果胶甲酯酶添加比例的增大，低盐黄瓜的硬度先增大后减小(见图3)。在果胶甲酯酶添加比例为0.60%时，低盐黄瓜的硬度显著地增大，以后随果胶甲酯酶添加比例的增大而没有明显的变化；当添加量大于0.80%时，黄瓜硬度明显下降。其中不添加果胶甲酯酶时，低盐黄瓜硬度为2 400 g左右，添加果胶甲酯酶的低盐黄瓜硬度明显高于未添加果胶甲酯酶的低盐黄瓜。在果胶甲酯酶添加比例为0.60%时，低盐黄瓜硬度最大为3 000 g左右。由此可知，在添加0.60%果胶甲酯酶时，低盐黄瓜硬化效果较优。

图3 果胶甲酯酶添加量对低盐黄瓜硬度的影响Fig.3 Effect of different additions of pectin methylesterase on hardness of low-salt cucumber

2.3 果胶甲酯酶作用温度的确定

随着果胶甲酯酶作用温度的升高低盐黄瓜的硬度先增大后减小，见图4。在果胶甲酯酶作用温度为40～50 ℃时，低盐黄瓜的硬度显著地增大；当酶作用温度为50 ℃时，低盐黄瓜的硬度最大达到3 450 g左右；以后随果胶甲酯酶作用温度的升高而明显下降，当作用温度达到60 ℃时，黄瓜硬度下降到最低点。乐毅等[23]同样也证明了，当作用温度超过50 ℃时，果胶甲酯酶空间结构发生了改变，导致酶变性。宗迪等[24]证明了果胶甲酯酶在85 ℃时即可以失活，温度过高，果胶甲酯酶的活性受到抑制，低盐黄瓜硬度下降。由此可知，在果胶甲酯酶作用温度为50 ℃时，低盐黄瓜保脆效果较优。

图4 果胶甲酯酶作用温度对低盐黄瓜硬度的影响Fig.4 Effect of different enzymatic temperatures of pectin methylesterase on hardness of low-salt cucumber

2.4 果胶甲酯酶作用时间的确定

随着果胶甲酯酶作用时间的延长低盐黄瓜的硬度呈现出下降的趋势，见图5。果胶甲酯酶作用时间为10～20 min时，低盐黄瓜的硬度显著地增大；当作用时间为20 min时，低盐黄瓜硬度达到3 300 g左右；当酶作用时间为20～50 min时，低盐黄瓜的硬度随作用时间的延长持续下降；当作用时间达到50 min时，黄瓜硬度下降到最低点，硬度仅2 300 g左右。长时间酶的作用，会导致黄瓜内的果胶物质被分解，果胶含量与黄瓜的硬度呈正相关。由此可知，在果胶甲酯酶作用时间为20 min时，低盐黄瓜脆度较优。

图5 果胶甲酯酶作用时间对低盐黄瓜硬度的影响Fig.5 Effect of different enzymatic time of pectin methylesterase on hardness of low-salt cucumber

2.5 外源性果胶甲酯酶优化作用条件正交试验结果

极差R由大到小的顺序为B、D、A、C，也就是说，对于外源性果胶甲酯酶保脆的工艺，果胶甲酯酶添加量的影响最大，其次是酶作用时间、乳酸钙添加量、酶作用温度(见表2)。结果表明，组合A2B1C2D2为最佳组合，即乳酸钙添加量0.40 g/mL、酶添加量0.40%、酶作用温度50 ℃、酶作用时间20 min。通过验证实验对A2B1C2D2进行TPA质构测定，硬度为3 123.441 g，说明A2B1C2D2为低盐黄瓜添加外源性果胶甲酯酶的较优作用条件。

表2 果胶甲酯酶优化作用条件正交试验结果

2.6 外源性果胶甲酯酶对低盐腌渍黄瓜质地的影响

果胶含量的多少，直接影响了果蔬的质构品质[25]。对按正交试验所得的添加外源性果胶甲酯酶优化作用条件处理后的和未添加外源性果胶甲酯酶的低盐腌渍黄瓜分别进行质构和果胶含量的测定，探究果胶甲酯酶的添加对低盐腌渍黄瓜硬度、咀嚼度和果胶含量的影响。

2.6.1外源性果胶甲酯酶对低盐腌渍黄瓜质构性质的影响

经过酶处理的低盐腌渍黄瓜与未经酶处理的低盐腌渍黄瓜在硬度和咀嚼度上的对比结果见图6。从图6可以看出：初始黄瓜样品的硬度较高，为3 349.767 g，具有较好的脆度。将经过酶处理和未经酶处理的黄瓜样品进行比较发现：经过酶处理的低盐腌渍黄瓜样品在硬度上略高于未经过酶处理的样品，分别为2 502.028、2 393.135 g，差值为108.893 g。初始黄瓜样品的咀嚼度较高，为232.879 g，具有较好的咀嚼度。将经过酶处理和未经酶处理的黄瓜样品进行比较发现：经过酶处理的低盐腌渍黄瓜样品在咀嚼度上也略高于未经过酶处理的样品，分别为232.314、231.047 g，差值为1.294 g。通过数据分析，添加果胶甲酯酶的样品能更好地维持黄瓜的硬度，证明了果胶甲酯酶与Ca2+发生交联作用，形成的果胶酸钙网络能够使得低盐腌渍黄瓜保持其硬度。添加果胶甲酯酶同样也能更好地维持黄瓜的咀嚼度，保持了低盐腌渍黄瓜的口感，通过对添加和未添加果胶甲酯酶的低盐腌渍黄瓜硬度、咀嚼度进行分析，发现酶处理在维持低盐腌渍黄瓜硬度、咀嚼度上起到了较好的效果，果胶甲酯酶在低盐腌渍工艺中的保脆护脆方面发挥了重要作用。

图6 不同处理方式样品的硬度和咀嚼度Fig.6 Hardness and chewiness of samples treated by different processing methods

2.6.2外源性果胶甲酯酶对低盐腌渍黄瓜果胶含量的影响

图7 不同处理方式样品的果胶含量Fig.7 Pectin contents of samples treated by different processing methods

不同处理方式样品的果胶含量测定结果见图7。初始黄瓜样品中的果胶质量比为1.318 g/kg，经过酶处理的黄瓜样品的果胶质量比低于初始黄瓜，为1.284 g/kg，未经过果胶甲酯酶处理的样品，果胶含量仅有0.824 g/kg。外源性果胶甲酯酶的添加，一定程度上弥补了腌制过程中，Na+置换原果胶中的Mg2+和Ca2+，使得原果胶含量下降，硬度下降。梅明鑫等[25]、陈光静等[26]分别对腌制萝卜和腌制大叶麻竹笋进行扫描电镜观察，发现果蔬经过腌制处理后，细胞膜破裂，细胞壁和中胶层变得收缩、塌陷，进一步验证了这一结论。同时，添加外源性果胶甲酯酶而形成的果胶金属桥，使得蔬菜组织变得更脆嫩[12]，更好的维持了低盐腌渍黄瓜的口感，并与图6中TPA测试结果一致。

3 结 论

通过单因素实验、正交试验结合全质构分析测试，确定并优化了低盐腌渍黄瓜添加外源性果胶甲酯酶作用条件，即乳酸钙添加量0.40 g/mL、酶添加量0.4%、酶作用温度50 ℃、酶作用时间20 min；研究了优化条件下添加外源性果胶甲酯酶对低盐腌渍黄瓜果胶含量和质构性质的影响。结果表明，经过果胶甲酯酶作用的低盐腌渍黄瓜样品在硬度、咀嚼度和果胶质量比上分别高出未添加果胶甲酯酶的低盐腌渍黄瓜样品108.893 g、1.294 g、0.460 g/kg，添加果胶甲酯酶改善了低盐腌渍黄瓜的质构性质。