枯草芽孢杆菌NBF809防治番茄棒孢叶斑病研究

黄大野 曹春霞 张亚妮 王开梅 饶 犇 万中义 周荣华 杨自文

（湖北省生物农药工程研究中心，湖北武汉430064）

番茄棒孢叶斑病是由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的一种重要病害，在世界多数番茄种植区域都有发生，近年来传入我国，对我国番茄生产造成了严重的影响（Kodama & Hasama，1994；Schlub et al.，2009；李明远，2015；杜公福 等，2017）。多主棒孢寄主广泛，除了侵染番茄，还能侵染黄瓜和茄子等蔬菜以及花卉和橡胶等5 300余种植物，侵染破坏力强，传播途径广，极易变异，导致其由次要病害上升为世界公认的主要病害（Smith et al.，2009；高苇 等，2011；李宝聚 等，2012）。

国内缺少相应的番茄抗性品种，化学防治仍然是防治棒孢叶斑病的主要手段。但该病菌极易产生抗药性，目前已有其对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、乙霉威和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗药性的报道（Hasama et al.，1991；Date et al.，2004；Ishii et al.，2007；Miyamoto et al.，2009；Huang et al.，2013）。同时，化学杀菌剂的频繁使用也会对人体健康和生态环境造成影响，因此亟须更为安全有效的防治方法。近年来应用芽孢杆菌作为生防菌防控真菌性和细菌性病害已经有大量报道，因其能有效预防和控制作物病害，被普遍认为是一种环境友好且安全有效的防治方法（Köberl et al.，2013）。

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisNBF809是由湖北省生物农药工程研究中心分离和保存的具有高杀菌活力的菌株，前期研究表明其对多种植物病原菌有良好的抑制作用，本试验研究其对番茄棒孢叶斑病的防治效果，以期为以后的田间示范和应用推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌NBF809分离自番茄根际土壤。番茄棒孢叶斑病菌由湖北省生物农药工程研究中心分离保存。50%啶酰菌胺水分散粒剂由德国巴斯夫公司生产。番茄品种为中杂109，中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育。细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，Marker D2000购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 离体对峙试验

将NBF809菌株接种于LB液体培养基中，25℃、180 r·min-1振荡培养18 h备用。番茄棒孢叶斑病菌经斜面活化到PDA平板5 d后，用打孔器打取4 mm菌饼接种于PDA平板中央，在距离菌饼25 mm处等距离取4个点接种NBF809，每点5 μL。以不接种NBF809作为对照，25 ℃培养6 d后观察抑菌效果。刮取抑菌带边缘棒孢叶斑病菌菌丝，在显微镜（OLYMPUS CX21，Tokyo，Japan）下观察其与对照菌丝的形态区别。

1.3 枯草芽孢杆菌NBF809对番茄棒孢叶斑病的防效

盆栽试验于2017年7月在湖北省农业科学院玻璃温室进行，播种催芽的番茄种子，在常规管理下培养30 d后备用。多主棒孢C. cassiicola孢子制备按照Miyamoto等（2009）的方法。将斜面保存的多主棒孢接种到PDA平板上活化并继续进行扩繁，25 ℃黑暗培养10 d，随后用无菌手术刀片刮去菌丝，在BLB（black light blue）灯下25 ℃培养3 d产孢（李宝聚 等，2012）。刷取孢子溶于无菌水中，利用血球计数板调整孢子浓度到1×104个·mL-1备用。

按照1.2的方法制备NBF809发酵液，调整芽孢数为1×108cfu·mL-1，喷施于番茄叶片表面至饱和，以50%啶酰菌胺水分散粒剂有效成分用量200 μg·mL-1为药剂对照，喷施清水为空白对照。每处理3次重复，每重复32株番茄。24 h后喷施病原菌孢子悬浮液至叶片饱和，25 ℃保湿培养3 d，统计对照和各处理病情指数并计算防效。

病害分级按照Ishii等（2007）的标准。0级：无病斑，0.1级：病斑占叶面积＜1%，0.5级：病斑占叶面积1%～5%，1级：病斑占叶面积6%～10%，2级：病斑占叶面积11%～20%，3级：病斑占叶面积21%～30%，4级：病斑占叶面积31%～40%，5级：病斑占叶面积41%～50%，6级：病斑占叶面积51%～60%，7级：病斑占叶面积61%～70%，8级：病斑占叶面积71%～80%，9级：病斑占叶面积81%～90%，10级：病斑占叶面积＞90%。

病情指数=∑（各级植株数×级别）/（调查总株数×最高代表级别）×100

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

1.4 NBF809菌株抗菌素生物合成基因的鉴定

以细菌DNA提取试剂盒提取NBF809菌株基因组DNA，通过PCR对NBF809菌株的抗生素生物合成基因进行检测，共检测23组基因（表1），合成 Bacillomycin D、Bacilysin、Ericin、Fengycin、Iturin、Mersacidin、Mycosubtilin、Sublancin、Subtilin、Subtilosin和Surfactin 11种抗菌素，引物序列和反应条件参考Chung等（2008）的方法。

1.5 数据处理

使用SAS 9.1.3软件进行数据处理，在0.05水平下进行单因素差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 NBF809菌株对多主棒孢的离体抑制效果

NBF809菌株和多主棒孢对峙培养6 d后，病菌菌落和NBF809之间具有明显的抑菌带（图1）。通过光学显微镜下（40倍）观察，和对照菌丝相比，抑菌带边缘多主棒孢菌丝发生明显的肿胀变形及扭曲（图2）。

图1 离体对峙培养结果

图2 显微镜下NBF809对峙培养多主棒孢的菌丝形态

2.2 NBF809菌株对番茄棒孢叶斑病的防效

盆栽试验结果表明（表2），施用1×108cfu·mL-1枯草芽孢杆菌NBF809发酵液对番茄棒孢叶斑病具有良好的防治效果，病情指数显著低于清水对照，防治效果达到73.26%，对照药剂50%啶酰菌胺水分散粒剂的防效最佳。

表1 聚合酶链式反应检测NBF809抗菌素生物合成基因

2.3 NBF809菌株抗菌素生物合成基因的鉴定

通过23组抗菌素合成基因的筛选，对NBF809菌株产生抗菌素基因进行检测，共检测到5个合成抗菌素基因，分别为bacD、ituC、ituD、mrsM和mycC（图3），所对应抗菌素为Bacilysin、Iturin、Mersacidin 和Mycosubtilin 。片段大小与预期相似，序列相似度均大于95%。

表2 枯草芽孢杆菌NBF809对番茄棒孢叶斑病的防效

图3 合成抗菌素基因的扩增结果

3 结论与讨论

本试验结果表明，从番茄根际土壤分离到的枯草芽孢杆菌NBF809在温室条件下对番茄棒孢叶斑病具有良好的防治效果。通过对代谢产物进行鉴定，发现其产生4种抗菌素，这些成分可能在病害防治中起到重要作用。除了抗菌代谢产物的分泌，其他的作用机制如诱导抗性、在番茄叶片的定殖能力等需要进一步确定（Ukness et al.，1993；Pieterse et al.，1998；Bais et al.，2004）。

枯草芽孢杆菌可以防治灰霉病、白粉病、枯萎病和稻瘟病等多种病害（陈志谊，2015），但在番茄棒孢叶斑病上的生物防治应用为首次报道。棒孢叶斑病极易产生抗药性，NBF809菌株对于棒孢叶斑病抗性菌株的治理具有一定的作用，同时NBF809菌株与化学杀菌剂的混用有助于延缓杀菌剂对病原菌的抗性压力，NBF9809菌株与化学杀菌剂的相容性、最佳配比及田间应用技术需要进一步研究。

本试验开展了离体抑菌和活体盆栽试验，由于芽孢杆菌在田间应用时会受到温度、湿度、土壤、pH值等外界因素的影响（van Rij et al.，2004），因此其田间防治效果需要进一步进行评价。