连作辣椒根围化学成分鉴定与动态分析

袁 圆， 张爱民， 王永平， 梁传静， 廖芳芳， 吴康云， 张 明， 邢 丹

(1.贵州省农业科学院辣椒研究所，贵州贵阳 550006； 2.中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550002)

辣椒是贵州地区重要的经济作物之一。遵义市地处贵州省北部，处于云贵高原向湖南丘陵和四川盆地过渡的斜坡地带，地形起伏大，地貌类型复杂，海拔高度一般在800～1 300 m，属亚热带季风气候，终年温凉湿润，冬无严寒、夏无酷暑，雨量充沛，日照充足，全境可以种植辣椒，是全国闻名的辣椒主要种植区，拥有全国最大的辣椒集散交易中心，辣椒品质在全国名列前茅。近年来在当地政府的扶持下，辣椒规模逐年增加，至2016年种植规模为13万多hm2，占全省辣椒种植总面积的48%，主要种植品种有圆颗粒、小米椒、子弹头、二荆条等[1]。

辣椒在连年栽培的过程中受连作障碍的严重威胁，其产量及品质降低。化感物质的累积是产生辣椒连作障碍的主要因素之一，也是辣椒集约化发展的一个瓶颈，研究发现，在连作栽培中辣椒根系会分泌一些化感物质，譬如酚酸类物质，这些酚酸物质会随着连作时间的增加在土壤中不断富集，进而抑制辣椒植株生长。此外，上茬作物收获后，其残留植物体的分解也会释放部分酚酸物质，不利于辣椒植株的生长。酚酸物质的累积可为土壤中病原微生物提供碳源，降低土壤pH值，影响植株对养分和水分的摄取，进而导致植株抵抗力下降，为病原菌的侵入创造有利条件，从而引起土传病害的大暴发，危害辣椒的产量以及品质。研究表明，植物所释放的化感物质可归为以下几类：水溶性有机酸类、不饱和内酯、脂肪酸和多炔、醌类物质、酚类、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素类；类黄酮、单宁、类萜和甾类化合物、氨基酸和多肽、生物碱和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等[2]。目前有关遵义市连作辣椒根际周围化学成分鉴定与动态变化研究的相关报道较少，本研究通过分析不同辣椒品种、生育期及种植年限的根系及土壤化学成分，结合已被广泛报道具有化感作用的组分，剖析遵义市辣椒主产区辣椒根系与根际土壤主要化学成分及潜在的化感物质种类及积累情况，旨在为深入研究辣椒化感物质与自毒作用提供参考，为更好更快地解决辣椒连作障碍提供基础理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 选择黔椒5号(线椒)、辣研2号(朝天椒)、绥阳小米辣(本地品种)3个品种作为供试材料，其中黔椒5号和辣研2号分别为贵州省农业科学院园艺研究所和贵州省农业科学院蚕业辣椒研究所选育的杂交品种，绥阳小米辣为当地自留种。

1.1.2 供试仪器 HP6890/5975C 气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(美国安捷伦科技公司)、EYELA N—1100旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)、SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、KQ300DE型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 田间小区设计 将3个辣椒品种[黔椒5号(线椒)、辣研2号(朝天椒)、绥阳小米辣(本地品种)]分别种植在面积为667 m2的连作地(连续种植辣椒10年)和非连作地(第1年种植辣椒)里，其中每块地均分为3个小区，每个小区按随机区组对3个辣椒品种进行排列种植，每个品种种植60株，生长期内采用相同的栽培措施及管理模式。

1.2.2 样品采集 于2016年7—8月(辣椒盛花期和盛果期)采集遵义市永乐镇辣椒连作地及非连作地辣椒根系及根际土壤，按照五点取样法，分别选择黔椒5号(线椒)、辣研2号(朝天椒)、绥阳小米辣(本地品种)3个品种进行采样，并带回实验室进行GC-MS化学成分鉴定与分析。

1.2.3 样品前处理 将土样和根系样品放置在阴凉通风处自然风干，然后将土样研磨后过40目筛备用，根系样品粉碎后备用。分别称取4 g土壤样品和1 g根部样品，加入20 mL提取液(甲醇 ∶乙酸乙酯=1 ∶1)浸提，于超声清洗机超声2次(每次30 min)后放置过夜。将浸提液于3 000 r/min转速下离心5 min，将样品溶剂部分于35 ℃减压浓缩，土壤样品加200 μL甲醇溶解，根系样品加2 mL甲醇溶解，于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 样品检测 采用气相色谱-质谱联用仪鉴定样品化学成分，进样量为2 μL。

检测条件：色谱柱为AB-INOWAX(30 m×0.25 μm×0.25 mm)毛细管柱。程序升温：初始温度40 ℃(保持 2 min)，以5 ℃/min升温至240 ℃后，保持16 min。运行时间：58 min，汽化室温度为250 ℃，载气为高纯He(99.999%)，柱前压为7.65 psi，载气流量为1.0 mL/min，不分流。溶剂延迟时间：5.0 min。

质谱条件：离子源为电子轰击离子源(EI)，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电子能量为70 eV，发射电流为34.6 μA，倍增器电压为 1 812 V，接口温度为280 ℃，质量范围为29～500 amu。

化学成分鉴定：对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图，检索出相应的物质，确定化学成分，并通过峰面积归一化法测定各化学成分的相对质量分数，从而得到不同物质及组分在根际及土壤中的百分数。

1.3 数据处理

通过Excel 2007进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 辣椒根际土壤化学成分鉴定与分析

由表1可知，7月辣椒盛花期根际土壤浸提液共检测出14类46种物质，其中烷类2种、酯类6种、酸类1种、酚类1种、醇类16种、酮类4种、醛类7种、酰胺类3种、其他类6种。所检测出物质的相对质量分数在不同处理中存在一定的差异，其中绥阳小米辣连作地土壤中的醇类物质相对质量分数总和高达54.85%，明显高于其非连作地及黔椒5号、辣研2号2个品种连作地和非连作地土壤中的含量；在同一辣椒品种中，醛类物质总的相对质量分数整体呈现出非连作地比连作地高的趋势，其中香草醛是已被报道的化感物质[3-5]，在连作条件下检测出绥阳小米辣根际土壤所占的相对质量分数为 0.67%，在非连作地没有被检出；酸类物质中棕榈酸在绥阳小米辣非连作地的相对质量分数为9.76%，在其余5个处理中没有被检出。棕榈酸甲酯[6-12]、γ-丁内酯[13]、苯甲醛[14-15]、苯并噻唑[16-17]已在烟草等作物上报道具有化感作用，本研究在辣椒土壤也有检出，但是含量较少。

由表2可知，8月辣椒盛果期土壤浸提液共检测出14类56种物质，比7月盛花期多10种物质，其中酸类物质检测出有9种，比7月多8种；醛类检测出9种，比7月盛花期增加2种物质，并检出酯类7种、酚类1种、醇类16种、酮类4种、酰胺类3种、其他类7种，可以看出，醇类、醛类、酸类数量较多，酮类、酯类次之。在绥阳小米辣连作地中，酸类物质的总相对质量分数为45.78%，十七(烷)酸、十八(烷)酸/硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸/十八烯酸、亚油酸、棕榈酸[6-12]等物质都被证实具有化感作用，其中棕榈酸相对质量分数最高，为 28.43%；相比连作地，绥阳小米辣非连作地均未检出相应物质。杂交品种黔椒5号(线椒)在连作地及非连作地土壤中未检测出酸类物质，杂交品种辣研2号(朝天椒)仅在非连作地土壤里检测出棕榈酸。醛类物质相比7月共同含有的物质有对羟基苯甲醛、二甲基缩醛、4-甲基苯甲醛、苯甲醛、糠醛。由表2可知，辣椒盛果期没有烷类物质被检出，醛类物质在绥阳小米辣中，非连作地的总相对质量分数明显比连作地高，在黔椒5号、辣研2号中却是相反。

2.2 辣椒根系化学成分鉴定与分析

由表3可知，盛花期根系浸提液共检测出13类77种物质，其中酸类21种、酯类9种、酚类5种、醇类16种、酮类7种、醛类8种、酰胺类4种、其他类6种，酸类物质数量占到总检测数目的27.27%，醇类次之，占20.78%，酚、酸类共占 33.77%。根系浸出液中总相对质量分数最高的为酸类，绥阳小米辣、黔椒5号、辣研2号非连作地和连作地中的占比分别为71.58%和76.93%、63.12%和80.08%、78.96%和 68.38%，可以看出，连作地含量高于非连作地的品种有绥阳小米辣和黔椒5号。3个辣椒品种中酯类物质相对质量分数整体呈现出连作地比非连作地高的规律。酚类物质中3个辣椒品种非连作地、连作地共有的物质为4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。醛类物质中连作地比非连作地相对质量分数高的品种为绥阳小米辣和黔椒五号，香草醛除了在绥阳小米辣非连作地未被检出，在其余5个处理中均检出，且连作地含量明显比非连作地占比高。

表1 辣椒盛花期根际土壤化学成分分析

注：“—”表示未检测出。下表同。

表2 辣椒盛果期根际土壤化学成分分析

续表2

表3 辣椒盛花期根系化学成分分析

续表3

由表4可知，盛果期根系浸提液共检测出11类共63种物质，其中酯类8种、酸类20种、酚类5种、醇类11种、酮类6种、醛类6种、酰胺类2种、其他类5种，总体比7月盛花期数量相对减少，但同样以酸类最多，占31.75%，醇类次之，占17.46%。棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸在几个品种中的相对质量分数较高。在黔椒5号、辣研2号、绥阳小米辣非连作及连作地根系中，酚类、酯类总相对质量分数连作地比非连作地高。酸类组分在绥阳小米辣和黔椒5号根系中呈连作地高于非连作地趋势。酰胺类物质只有硬脂酸酰胺和油酸酰胺2种，且占比不是很高。水杨酸甲酯[18-20]、棕榈酸甲酯[6，14，21-22]、硬脂酸甲酯[6]、苯甲酸[14-15]、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸[6]、硬脂酸[23-27]、香草酸[6]、花生酸[27]、苯甲醇[14]、叶绿醇[15，22]、苯甲醛[28]、香草醛[4-5，15]已在烟草等作物上被报道具有化感作用，它们在本研究中也被检出，但是被检相对质量分数较小。

表4 辣椒盛果期根系化学成分分析

续表4

3 结论与讨论

从本研究可以看出，辣椒盛花期及盛果期根系及根际土壤的化学成分数目、种类及相对质量分数总体呈动态变化趋势，如醇类物质是辣椒根系及土壤中检测到的所有物质中占比较高的一类组分，不同时期均检测出10种以上物质；烷类物质只在7月的连作土壤里检出；酯类组分数目随着生育期的推移，在土壤中呈小范围上升趋势；酮类成分在盛花期和盛果期的根际土壤中都被鉴定出4种有效组分，比辣椒根系的含量少2～3种；醛类物质随着生育期的推后，在土壤中数量增多，在根系中减少。植株根系通过与土壤进行物质交换，通过乙酸途径合成化感物质，根部酸性增加，土壤微生物在根部积累，自毒物质降低了植株生长能力和抵抗力，与多年累积的病原菌共同作用，形成严重的土传病害，是连作障碍产生的重要原因[29]，关于其物质交换代谢机制及途径有待深入研究。

不同辣椒品种、生育期及种植年限对辣椒根系及土壤化学成分的影响不同，主要是由于在辣椒生长阶段根系会向土壤中分泌大量的根系分泌物，而有机酸是分泌物的主要成分，长期连作后，根系分泌物会在土壤中不断积累[30]。如本研究中酚、酸类物质在7月即辣椒盛花期时，根系里共检测出26种物质(其中许多物质是已被证实为具有化感作用的物质)，土壤中检出2种；但通过1个生育期的积累即到辣椒盛果期时，根际土壤中酚、酸类物质的数目迅速提高到10种，根系的数目仅比之前减少1种，这种积累趋势与诸多文献报道一致。并且研究发现，当地品种绥阳小米辣连作地根际土壤中的酚、酸类物质数目增长速度最快，从最初的1种物质增长到10种，其酸类组分相对质量分数提高45.78百分点，明显高于其非连作地和其他品种的处理，且根系中酚、酸类物质的初始相对质量分数比杂交品种黔椒5号(线椒)和辣研2号(朝天椒)平均数要高。相比之下，黔椒5号和辣研2号虽然在根系检测出的酚、酸类物质也比较多，但在其连作地及非连作地土壤里的检出量少且相对质量分数低。本研究可能从另外一个方向说明了生产中杂交种比本地自留种种植优势强的一个原因，另外也验证了根系分泌物和土壤化学成分随着连作年限增加的变化规律，如马云华等就黄瓜连作的研究表明，随着连作年限的增加，土壤中酚酸类物质明显积累[31]。本研究未能在土壤中检测到与须文报道的主要化感物质为烷类、酯类等相似的化学成分，可能与连作时间长短、品种有关或者存在地区差异[32]。

现已有大量研究证实酚酸类物质的积累会加剧作物土传病害发生等连作障碍，如随酚酸类物质处理浓度的升高，土壤尖孢镰刀菌和甜瓜疫霉菌数量呈持续上升趋势，导致黄瓜枯萎病发生[31]。茄子根系分泌物中自毒物质香草醛和肉桂酸助长了茄子黄萎病的发生[33]。苯甲酸和肉桂酸处理可显著提高西瓜幼苗枯萎病的发病率，随着苯甲酸和肉桂酸处理浓度的提高，西瓜枯萎病病情指数和死苗率逐渐上升[34]。近年来，随着辣椒经济价值的日益增长，辣椒产业规模化发展，贵州地区因地理条件有限，辣椒连作已呈现不可阻挡的趋势，然而连作障碍对作物品质及产量造成了不可估量的损害。本研究大致明确了当地品种绥阳小米辣以及杂交品种黔椒5号、辣研2号盛花期及盛果期植株根系及根际土壤化学成分，结合现有文献报道的化感物质种类，解析了连作与非连作过程中酚酸类化感物质的积累规律，可对指导地方农业生产提供一定的理论支撑，对科学解决辣椒连作障碍有长远意义，但是化感物质与品种的关系、不同活动时期变化规律、与微生物的关系、与环境的关系还有待进一步研究。