王 璐,孙小虎,白静慧,万义增*,陈素贤
(1.锦州医科大学,辽宁 锦州 121001;2.辽宁省肿瘤医院,辽宁 沈阳 110042)
结肠癌(Colorecal Carcinoma,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,具有发病率较高、进展迅速等临床特点[1,2]。寻找新的有效的CRC的治疗手段,已经成为目前亟待解决的主要问题。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜受体酪氨酸激酶,是原癌基因c-erbB1的表达产物;髓系细胞触发受体-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)是一种新型调控的炎症反应因子,主要参与急性炎症反应。新近的研究发现,TREM-1和EGFR可激活多种下游信号通路,产生多种后续的生物学效应,参与细胞生存、血管形成、肿瘤发生和发展、抗肿瘤免疫、肿瘤化疗耐药性等生理病理活动[3],在CRC肿瘤的发生和发展中存在密切的关系。本实验通过检测TREM-1和EGFR在结肠癌组织及癌旁组织中的表达情况,分析二者的相关性,进一步探讨TREM-1与EGFR的表达与CRC的临床病理特征的关系,为后续药物治疗提供新的靶点信息。
1.1.1 组织标本
选取我院2016年11月~2017年12月在辽宁省肿瘤医院大肠外科行手术切除并经病理证实为结肠癌的患者68例,选取受试患者病理蜡块标本及其临床病理资料作为疾病模型组;同时选取其相应癌旁组织(结肠癌边缘外≥5 cm)共68例作为对照组。所有病例经核实患者无重复,临床病理资料完整。
1.1.2 试剂及耗材
兔抗TREM-1抗人单克隆抗体(ab214202)购自英国A b c a m公司;兔抗人表皮生长因子(即用型)(GT209307)购自基因科技有限公司;柠檬酸抗原修复液购自:长岛抗体诊断试剂有限公司;EDTA抗原修复液购自北京雷根生物技术有限公司。
1.1.3 主要仪器
石蜡切片机(LEICA-RM213)购自德国莱卡公司;台式水浴恒温振荡器(TSHZ-A)购自上海跃进医疗器械厂;全自动化学发光免疫分析仪(SIEMENS Advia Centaur XP)购自德国西门子公司;Olympus光学显微镜(H-600)购自日本Olympus公司;德国生物信号显微镜购自德国Carl Zeiss公司。
1.2.1 实验分组和标本处理
本实验共分CRC模型组及TAC对照组2组。 CRC模型组(CRC组):选取结肠癌的患者,68例,经患者签署知情同意书后,受试患者病理蜡块标本及其临床病理资料作为模型组。TAC对照组(TAC组):选取相应癌旁组织(结肠癌边缘外≥5 cm),68例,作为对照组。
上述标本离体30 min内进行处理,按照分组要求切取面积约1.0 cm×1.0 cm的结肠组织作为受试组织。取出的结肠组织采用生理盐水漂洗,放入10%甲醛进行固定,标本常规脱水、石蜡包埋,进行SP免疫组化。
1.2.2 SP免疫组化
(1)将组织切片置于梯度酒精中。(2)采用高压修复。(3)滴加血清封闭非特异性位点。(4)甩掉多余血清,滴加配置好适当比例的一抗。(5)取出切片,PBS冲洗,吸水纸擦掉多余水分,滴加二抗。(6)滴加即用型SABC复合物,置于37℃孵育箱中后PBS冲洗。(7)每张切片分别滴加1滴新鲜配制的DAB液,适时用PBS冲洗终止反应。(8)视苏木素浓度复染一定时间,以盐酸酒精分化,自来水下冲洗(返蓝)。(9)脱水、透明。
1.2.3 结果判定
在400倍光镜下,每张组织切片随机选取10个视野;细胞核及细胞质染色评分:染色面积评估:随机选取10个视野,计数染色面积测定。0分:无阳性细胞;1分:≤25%;2分:26~50%;3分:51%~100%。染色强度评分:指多数阳性细胞呈现的染色特性:0分:无着色;1分:淡黄色;2分:棕黄色;3分:棕褐色。表达水平通过细胞染色比例及染色强度得分乘积判定。细胞膜评分:0分:无反应或少于10%的细胞膜染色;1分:≥10%的细胞膜出现微弱染色;2分:≥10%的细胞侧膜、基底侧膜或完全膜出现中度染色;3分:≥10%细胞强染色出现在侧膜、基底膜或全部染色;上述分数之和用来判断Trem-1和EGFR结果,>2分者为阳性,≤2分者为阴性。
1.2.4 Western blot检测
取5 mg组织加裂解液及蛋白酶抑制剂,对样品行BCA蛋白测定;制备样品,制胶后上样、电泳电压105 V;采用半干法转膜,取出含有目标蛋白的胶置于转膜液中,裁取与胶相匹配的PVDF膜,置于甲醇中约1分钟,而后置于转膜液中;接通转膜仪,取出PVDF膜将其与胶相邻面朝上置于BSA封闭液中,室温置于摇床2小时;从封闭液中取出膜,TBST洗膜3次,而后置于配置好比例的一抗中,摇床4℃过夜;次日取出膜,TBST洗3次,室温置于二抗孵育2小时;二抗反应完毕后TBST洗3次,将ECL试剂盒中A液与B液混合,置于分析仪中进行图像采集。
免疫组化实验结果采用SPSS 17.0软件对数据进行分析,组间计数资料比较时使用x2检验,相关性分析采用Spearman相关分析。Western Blot结果用Image Quant LAS 4000凝胶成像系统获得扫描图像后采用Image J软件分析灰度值,以P<0.05为差异具有统计学意义的评定标准。
免疫组化显示,在结肠癌组织中,TREM-1阳性定位于细胞核及细胞浆,在癌旁组织中,TREM-1主要表达于细胞膜,两者的TREM-1阳性表达率分别为69.1%及32.4%。两者比较;差异有统计学意义(P<0.05)。(见图1A,1B)。
图1 各组结肠组织TREM-1显微镜图片
Western blot实验结果显示,结肠癌组织中TREM-1的灰度值高于癌旁组织中TREM-1的灰度值,分别为0.892±0.039与0.773±0.024,具有显著性差异;差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
图2 各组中TREM-1蛋白的表达
EGFR染色结果显示,在结肠癌组织中,EGFR表达于细胞膜及细胞浆,在癌旁组织中,EGFR表达于细胞膜,两组的EGFR阳性表达率分别为72.1%及32.4%,两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3A,3B。
图3 各组结肠组织EGFR显微镜图片
Western blot实验结果显示,与TAC组相比,CRC组中灰度值水平明显升高,分别为0.066±0.002与0.042±0.006,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。
图4 各组中EGFR蛋白的表达
TREM-1的表达与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小及TNM分期无相关性;差异无统计学意义(P>0.05)。TREM-1在有、无淋巴结转移的结肠癌组织中的阳性率分别为82.1%和51.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR的表达与年龄、性别、组织分化程度无相关性,差异有统计学意义(P>0.05),与浸润深度、淋巴结转移、临床分期存在相关性;差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 受试患者中TREM-1和EGFR的表达与临床病理特征的关系 [n(%)]
在CRC组的68例结肠癌组织中,TREM-1和EGFR共同阳性表达例数为36例,共同阴性表达例数为8例,经x2检验分析,两者之间的表达成正相关;差异有统计学意义(r=0.721,P<0.05)。见表2。
表2 结肠癌组织中TREM-1和EGFR的表达相关性
结肠癌(CRC)是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一,具有发展迅速、转移速度较快、侵袭范围广范等临床特点。目前的主要治疗手段为手术治疗和放化疗的综合治疗。目前,CRC的复发和转移依然是CRC患者死亡的主要因素[1,4]。然而,目前临床上CRC的靶向治疗尚处于初级阶段,因此,充分了解CR发生、发展的生物学特征及其生物靶点是探讨CRC的发病机理是防治CRC的重要环节。
本实验选取的受试CRC疾病模型的患者共68例,其中60岁以上占70%,多数浸润浆膜层,pTNM分期以II期、III期为主,分化程度以中分化为主。该结果可见,CRC是老年常见疾病之一,并且发病迅速、侵袭范围广泛,且淋巴结浸润也常见。本实验结果提示,EGFR在CRC中存在过度表达,且与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度存在相关性。
根据本实验EGFR的免疫组化染色及Western blot结果显示,在结肠癌组织中,EGFR主要表达于细胞膜及细胞浆。EGFR是新型的炎症因子之一,发现其广泛分布于哺乳动物的上皮细胞、胶质细胞和角质细胞以及成纤维细胞等表面[5,6]。另外,新近的研究也发现,EGFR的信号通路对多种细胞的生长、增殖和分化等生理及病理过程发挥重要的作用,同时与肿瘤、糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)、免疫缺陷性疾病及心血管疾病也密切相关[7,8]。研究也表明,在结肠、直肠癌中,基因K-ras突变率达到35%-45%,已成为EGFR抗体治疗转移性结直肠癌(Metastatic colorectal cancer,MCRC)的主要疗效预测标志物,也开创了MCRC个体化治疗的第一步[9]。这提示我们,在CRC的治疗中,EGFR可作为CRC患者治疗效果的指标和靶点之一,是现今研究的热点。
本实验通过免疫组化的方法检测到,TREM-1在CRC组织主要定位于细胞核及细胞浆中,在CRC中的阳性表达率高于癌旁组织。Western blot实验结果显示,与TAC组相比,CRC组中灰度值水平明显升高。Trem-1是一种炎症激发的新型受体,有相关研究表明,Trem-1参与了多种炎症反应的级联放大过程,某些炎症成分及炎症效应可以上调细胞表面的TREM-1的表达[10,11]。TREM-1能协同激活TREM-1的配体,从而引起TREM-1受体向下游传递信号,随后会诱导前炎性因子的产生并引起相关炎症反应的发生;在新近的研究中提示,TREM-1可能是肿瘤免疫调节的新靶点[12]。该实验结果提示,TREM-1与CRC的发生、发展相关,可能成为CRC诊断及治疗的新作用靶标。
另外,在本实验结果中也证实,TREM-1和EGFR两者之间的表达呈现正相关,提示两者在CRC中存在某种协同作用。同时本次实验也证实,TREM-1的表达与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小及TNM分期无相关性,与淋巴结是否转移相关,差异具有统计学意义;EGFR的表达与年龄、性别、组织分化程度无相关性,与浸润深度、淋巴结转移及临床分期存在相关性。
综上所述,本实验结果证明了TREM-1和EGFR在CRC组织中的高表达,对结肠癌的的发生、发展起调节作用,为临床防治CRC提供了重要的理论依据。