大黄素对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的抑制作用及机制

程锦绣 郝军荣 刘翠兰 王琳琳 卫志锋 刘圣君 刘华

1河北北方学院附属第一医院肾内科（河北张家口 075000）；2河北北方学院药理教研室（河北张家口075000）

腹膜透析为肾衰竭治疗的方法之一。有研究指出，长期进行腹膜透析过程中可出现腹膜炎症及腹膜结构进展性的损伤［1］，进而发展为腹膜纤维化，导致患者退出腹膜透析治疗。由于腹膜纤维化的发病机制较为复杂，此前治疗针对性不强，给腹膜纤维化的治疗造成障碍［2］，因此，探究腹膜纤维化的病理机制及治疗方法为临床研究的难点。大黄素为大黄的主要活性成分，其具有抗肿瘤、抗炎等活性。研究表明，大黄素在肾纤维化、胰腺纤维化、心室纤维化的治疗中表现出较好的作用［3-5］，因此推测其对腹膜纤维化具有一定抑制作用。目前关于大黄素对腹膜纤维化的研究较少且国内未对大黄素治疗腹膜纤维化的有效剂量进行探讨，因此本研究建立腹膜纤维化大鼠模型，研究其对大鼠腹膜纤维化的相关机制并对其剂量简要分析。

1 材料与方法

1.1实验材料大黄素（广东中山康之源生物科技有限公司）以生理盐水配制成35 mg/kg的工作液；采用Primer Premier 5.0设计Notch1、Jagged-1、Hes-1、β-actin引物序列（表1）。实验动物采用3个月龄雄性SD大鼠，购自河北大学实验动物中心。胎牛血清、DMEM/F12培养基、胰酶、双抗（美国Gibico）；RT-PCR试剂盒（日本Takara）；大鼠PⅢNP试剂盒（美国赛默飞）；Notch1试剂盒、Jagged-1试剂盒、Hes-1试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；一抗及二抗稀释液、辣根过氧化物酶连接的二抗（上海生工生物工程）；TRIZOL RNA提取试剂盒（上海闪晶分子生物科技有限公司）。仪器包括低温高速离心机（美国Thermo）；RT-PCR仪（美国 ABI）；酶标仪（美国 BioTek）；恒温CO2培养箱（苏州净化有限公司）；石蜡包埋机、切片机（德国SLEE）。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2实验方法

1.2.1腹膜纤维化大鼠模型入选大鼠每日腹腔注射4.25%葡糖糖透析液（100 mL/kg），建立腹膜纤维化模型［6］。将造模成功大鼠随机分为B组、C组、D组，每组10只，选取10只未造模大鼠为空白对照组（A组）。B组大鼠培养3周后处死、C组培养6周后处死，D组在造模开始时腹腔注射大黄素（根据预实验结果为35mg/kg），与C组同时处死。

1.2.2腹膜纤维化大鼠超滤量、葡萄糖转运量腹膜透析结束后24 h，将大鼠麻醉腹腔注射4.25%葡糖糖透析液，5 h后，量取腹腔液体，同时留取大鼠透析结束0 h及5 h血液标本，测定葡萄糖浓度。超滤量：最后出水量-25 mL；葡萄糖转运量计算公式：葡萄糖转运量（mmol/kg）=（初始葡糖糖浓度×透析液体积）-（结束葡糖糖浓度×结束透析液出量）。

1.2.3腹膜组织学变化分别于3、6周处死大鼠，留取壁层和脏层腹膜，石蜡包埋连续切片，厚度为5 μm，HE染色。

1.2.4腹膜厚度观察石蜡包埋连续切片，厚度5 μm，常规脱水后，经天青石、铁苏木、丽春红酸性品红、1%磷钼酸、冰醋酸分化，亮绿染色，经95%酒精脱水，树胶封片，Masson染色，观察腹膜厚度。

1.2.5大鼠腹膜组织Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表达水平检测液氮研磨腹膜组织，加入Trizol提取总RNA。取总RNA 5 μL，80 ℃水浴5 min加入反转录液，45℃孵育72 min，留取产物待用。扩增参数，95℃变性10.5 min，60℃退火50 s，72℃延伸50 s，40个循环后，72℃最终延伸10 min，10℃最终保存。

1.2.6大鼠腹膜组织Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白的表达检测取腹膜组织，加入适量的RIPA裂解液和PMSF（100∶1）裂解壁层腹膜组织，4℃下3 000 r/min离心，取上清液置于-20℃冰箱。BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白浓度。

1.2.7PⅢNP水平检测收集大鼠血浆标本，采用酶联免疫法测定血浆PⅢNP水平。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，服从正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠组织病理学变化HE染色显示，A组壁层腹膜表面有一层扁平排列的细胞，B组可见腹膜表面细胞呈圆形、椭圆形，有脱落细胞，C组腹膜组织细胞明显脱落，纤维显现（图1）。Messon染色显示，A组腹膜组织较薄且呈连续分布，随时间推移，腹膜厚度增加，同时可见胶原沉积加重（图2）。

2.2各组大鼠超滤量、葡萄糖转运量、腹膜厚度及PⅢNP的变化B组、C组大鼠的超滤量降低，PⅢNP、腹膜厚度及葡萄糖转运量升高，变化幅度均高于A组（P＜0.05）；D组大鼠超滤量高于C组（P＜0.05），葡萄糖转运量、腹膜厚度及PⅢNP低于C组（P＜0.05）。见表2。

2.3大黄素对大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表达的影响C组大鼠3种蛋白的表达量明显增多；D组与C组相比，蛋白水平降低（P＜0.05）。见表3、图3。

图1 HE染色Fig.1 HE staining

图2 Masson染色Fig.2 Masson staining

表2 大鼠超滤量、葡萄糖转运量、腹膜厚度及血清PⅢNP的变化Tab.2 Changes in ultrafiltration volume，glucose transport volume，peritoneal thickness and serum PIIINP in model rats ±s

表2 大鼠超滤量、葡萄糖转运量、腹膜厚度及血清PⅢNP的变化Tab.2 Changes in ultrafiltration volume，glucose transport volume，peritoneal thickness and serum PIIINP in model rats ±s

注：与A组比较，*P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05

组别A组B组C组D组超滤量（mL）4.93±0.56 2.68±0.43*1.72±0.22*2.52±0.25*△腹膜厚度（μm）13.93±2.36 21.33±3.26*45.18±3.94*25.18±4.34*△PⅢNP（mg/mL）7.62±1.51 21.16±4.77*30.01±5.21*23.51±3.21*△葡萄糖准运量（mmol/kg）14.10±2.25 17.75±4.37*19.03±5.14*18.22 ± 5.10*△

表3 大黄素对大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表达的影响Tab.3 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 protein in rats ± s，%

表3 大黄素对大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表达的影响Tab.3 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 protein in rats ± s，%

注：与A组比较，*P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05

组别A组C组D组Notch1 101.55±24.34 174.24±50.28*109.85±19.43#Jagged-1 102.99±26.61 247.75±47.43*106.29±20.81#Hes-1 97.98±30.44 145.36±26.78*108.83±31.57#

图3 大黄素对模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表达的影响Fig.3 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 protein in model rats

2.4大黄素治疗后，模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表达的变化C组、D组3种mRNA表达高于A组，其中D组上升幅度低于C组（均P＜ 0.05）。见表4、图4。

表4 大黄素对模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表达的影响Tab.4 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 mRNA in model rats ± s，%

表4 大黄素对模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表达的影响Tab.4 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 mRNA in model rats ± s，%

注：与A组比较，*P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05

组别A组C组D组Notch1 103.42±26.84 347.84±52.18*263.85±42.33*#Jagged-1 105.28±33.26 224.73±47.83*148.09±30.21*#Hes-1 99.86±32.04 264.26±52.38*150.38±44.37*#

图4 大黄素对模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表达的影响Fig.4 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 mRNA in model rats

3 讨论

腹膜纤维化的形成由多种病因共同作用，大量研究表明，透析液中高糖、高渗、pH值以及反复发作的细菌性腹膜炎均参与腹膜纤维化的发生发展过程［7-8］。腹膜纤维化为导致腹膜透析技术失败的常见原因，因此明确腹膜纤维化的发病机制对了解腹膜纤维化过程并进行干扰、预防成为当前临床研究的热点之一。本研究通过建立腹膜纤维化大鼠模型，观察模型大鼠生理特征及特定蛋白的表达，并给予模型大鼠大黄素治疗，探讨引起大鼠腹膜纤维化的机制及药物治疗的效果。目前临床常见的造模方法有细菌性腹膜炎致腹膜纤维化、化学性腹膜炎致腹膜纤维化、转基因技术致腹膜纤维化及本研究采用的非生物相容性腹膜透析液致腹膜炎［9］。研究指出，细菌性、化学性腹膜炎造模方法产生的不良反应较多，而且其与实际腹膜纤维化发病的机制存在差异，因此不能满足研究需要；转基因技术造模技术要求较高，且其并未考虑腹膜纤维化形成的基本因素，因此在临床应用中并不理想［10］。本研究中所用方法考虑了导致腹膜纤维化的基本因素，更加符合临床实际［11］。本研究中从造模第3周起，发现模型大鼠超滤量明显降低，而葡糖糖转运量、腹膜厚度、及PⅢNP水平明显升高，在造模第6周，以上指标改变更加明显。

近来有研究指出，腹膜纤维化大鼠的纤维化及超滤功能可被PKC抑制剂及基因敲除所逆转，同时，可明显降低促炎、促纤维化等介质的生成［12］。腹膜纤维化引起的的超滤功能损伤已成为腹膜透析患者退出治疗的主要原因［13］。因此，保护间皮细胞层的功能是保障腹膜透析患者进行治疗预后的关键［14］。大量研究证实，一些细胞因子信号通路的激活为造成腹膜纤维化的重要途径［15］。本研究表明，Notch1信号通路明显激活，主要表现为在造模3周时，Notch1、Jagged-1、Hes-1等Notch1信号蛋白的表达明显上调，在造模6周达到顶峰；同时，本研究对造模大鼠进行大黄素治疗，结果表明，模型大鼠的超滤量明显增加，腹膜增厚及胶原沉积明显改善，葡萄糖转运量及PⅢNP水平也明显下降，提示，大黄素改善腹膜纤维化可能与调节Notch通路相关。

综上所述，本研究探讨了大黄素治疗腹膜纤维化的机制，为进一步解释腹膜纤维化的机制提供了证据，同时为治疗腹膜纤维化提供了新的靶点及治疗药物，下一步笔者将对大鼠进行长时间的观察，评价其生存质量并探讨不同剂量大黄素对腹膜纤维化大鼠的治疗作用，寻找最佳治疗剂量。