18F-ML-10 PET/CT显像检测荷瘤兔细胞凋亡的初步研究

陈顺军，宋乐乐，李彦鹏，王瑞华，程兵*

1.河南科技大学第一附属医院超声科，河南洛阳 471003；2.河南科技大学第一附属医院影像科，河南洛阳 471003；3.郑州大学第一附属医院核医学科，河南省分子影像医学重点实验室，河南郑州 450052；

多项肿瘤细胞凋亡显像研究表明，化疗后肿瘤细胞凋亡程度明显增加；在一定时间内行凋亡检测，能够探测肿瘤细胞的凋亡情况，达到监测化疗疗效的目的[1-6]。Cohen等[7]合成一种新的小分子化合物5-氟代烷基-2-甲基-丙二酸（5-fluoropentyl-2- methyl-malonic acid，ML-10)，能选择性地聚集于凋亡细胞，具有较好的临床应用前景[7-10]。国内关于18F-ML-10用于化疗后肿瘤细胞凋亡检测的报道较少。本研究利用紫杉醇诱导VX2肿瘤动物模型体内的肿瘤细胞发生凋亡。对细胞凋亡模型动物行18F-ML-10 PET/CT全身断层显像，测量肿瘤部位的最大标准化摄取值（maximum standardized uptake value，SUVmax）。对比相应的流式细胞仪定量检测细胞凋亡百分率，探讨18F-ML-10 PET/CT全身断层显像用于判断荷瘤兔体内细胞凋亡的可能性，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与动物 PET/CT成像系统（Siemens Biography True Point64 52环），Syngo工作站（Siemens True D融合软件），放射性活度测量仪器（Capintec CRC-25R/W型放射性活度测量仪器），18F-ML-10放射性核素示踪剂（郑州大学第一附属医院核医学科PET中心提供），压力蒸汽灭菌锅（YXQ-SG46-280S，上海博讯公司）。药物：麻醉药物（戊巴比妥钠：Merck公司，德国）、紫杉醇注射液（深圳万乐药业有限公司，规格：10 ml/60 mg，批号：H20056878）、生理盐水、碘伏。一次性使用留置针（24G AD医疗集团公司），无菌注射器，输液器，棉签，弯盘。流式细胞仪（Becton Dickinson公司），Annexin V FITC凋亡试剂盒（Invitrogen公司）。VX2荷瘤兔模型12只，雄性，体重2.0～3.0 kg，购自河南省实验动物中心[动物合格证号：SCXK（豫）2015-0004]。

1.2 实验方法 VX2细胞荷瘤兔12只，按完全随机化法分为化疗组和对照组，每组6只，化疗组经耳缘静脉输注紫杉醇注射液（按兔子体表面积175 mg/m2计算）诱导肿瘤细胞凋亡[11]，对照组静脉滴注等量生理盐水。2 d后，将12只兔逐个麻醉后，按兔体重计算 4.44×106Bq/kg（120 μCi/kg，0.2 ml）经耳缘静脉注射18F-ML-10，60 min后分别进行PET/CT显像。CT参数：常规全身扫描，80 kV，自动毫安；PET参数：1.5 min/床位，采集3个床位，扫描的图像采用迭代重建法重建，分别得到横断面、矢状面和冠状面CT、PET、PET/CT断层融合图像。应用ROI技术勾画瘤体，测定肿瘤组织的SUVmax。显像结束后，立即处死 VX2细胞模型动物，取出肿瘤组织，分为两部分，一部分用于流式细胞仪检测 VX2细胞凋亡情况，另一部分用作苏木精-伊红染色（hematoxylineosin staining，HE）观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件，用Mann-Whitney检验比较化疗组与对照组的差异；采用Spearman秩相关分析化疗组瘤体组织SUVmax与肿瘤细胞凋亡百分率之间的相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组VX2兔肿瘤模型SUVmax与细胞凋亡百分率比较 注射核素显像剂 60 min后行18F-ML-10 PET/CT全身断层显像，化疗组瘤体部位的SUVmax为 1.65±0.33，对照组瘤体部位SUVmax为 0.59±0.17，差异有统计学意义（P=0.004）。利用 Annexin VFITC/PI定量法检测VX2细胞凋亡情况，化疗组细胞凋亡百分率为（26.22±5.41）%，对照组为（4.55±2.23）%，差异有统计学意义（P=0.004）。

2.2 化疗组瘤体组织 SUVmax与肿瘤细胞凋亡百分率的相关性 化疗组瘤体组织SUVmax与肿瘤细胞凋亡百分率呈正相关（rs=0.943，P=0.005）。18F-ML-10 PET/CT全身断层显像显示：化疗组瘤体部位摄取18F-ML-10较明显，表现为放射性分布稍浓聚区（图1A）；对照组瘤体部位摄取18F-ML-10不明显（图1B）。

2.3 流式细胞仪检测VX2细胞凋亡情况 化疗组细胞凋亡百分率较多；对照组细胞凋亡百分比非常少（图2）。化疗组HE染色病理切片镜下见较多的凋亡细胞呈片状分布，对照组HE染色病理切片镜下所见以正常VX2细胞为主（图3）。

图1 VX2荷瘤兔动物模型18F-ML-10 PET/CT全身断层融合显像。A. VX2荷瘤兔紫杉醇化疗后，18F-ML-10 PET/CT全身断层融合显像，MIP图显示兔左侧腋窝水平放射性分布略浓聚，CT显示为左侧腋窝皮下肿瘤部位，PET/CT融合图像显示瘤体部位可见放射性分布略浓聚，SUVmax为1.76（箭）；B.对照组荷瘤兔18F-ML-10 PET/CT全身断层融合显像，CT显示肿瘤位于左侧腋窝皮下，MIP图、PET/CT融合图均显示肿瘤部位未见明显放射性分布浓聚，SUVmax为0.58（箭）

图2 流式细胞仪检测两组荷瘤兔VX2细胞凋亡百分率。A.经紫杉醇化疗后VX2细胞凋亡百分率：右上象限：Annexin V（+）／PI（+），晚期凋亡细胞（0.7%）；右下象限：Annexin V（+）／PI（-），早期凋亡细胞（30.7%），细胞凋亡百分比较高；左下象限：Annexin V（-）/PI（-），正常细胞（68.5%）。B.对照组VX2细胞凋亡百分率：右上象限：Annexin V（+）／PI（+），晚期凋亡细胞（2.3%）；右下象限：Annexin V（+）／PI（-），早期凋亡细胞（4.0%）；细胞凋亡百分比较低，左下象限：Annexin V（-）/PI（-），正常细胞（81.7%）

图3 荷瘤兔VX2肿瘤病理结果。紫杉醇化疗后VX2肿瘤病理切片显示较多的凋亡细胞呈片状及条状分布，细胞体积缩小，胞质浓缩、深染，细胞核浓缩（箭，A）；对照组VX2肿瘤病理图片显示极少量的凋亡细胞，呈单个分布，细胞体积缩小，细胞核浓缩，深染，内可见凋亡小体（箭，HE，×200，B）

3 讨论

细胞凋亡在肿瘤的治疗过程中具有重要作用，并直接影响肿瘤患者的预后。分子影像为实体检测细胞凋亡提供了有效工具[12]。ML-10是一种用于细胞凋亡检测的新型化合物，其原理是：磷脂酰丝氨酸（Ps）是构成细胞膜的成分之一，细胞正常状态下依靠移位酶和翻转酶维持Ps位于细胞膜内侧，凋亡发生早期，这两种酶活性丧失，而另外一种爬行酶的激活使Ps由膜内侧移向外侧，并且暴露在细胞膜外侧，在细胞膜上，细胞膜的酸化使18F-ML-10酸化，酸化后的18FML-10结构发生改变，细胞膜上的爬行酶激活和细胞膜不可逆的去极化，促进已经酸化的18F-ML-10通过细胞膜疏水性的结构进入细胞内，酸化18F-ML-10与胞质内带负电荷的蛋白结合，促使更多的18F-ML-10进入细胞内，引起细胞内ph系统功能紊乱，当细胞内pH值降低到细胞质内蛋白质等电点以下，细胞发生脱水、皱缩等凋亡细胞所特有的改变，以上变化相互协同完成，导致18F-ML-10集聚在凋亡细胞内，这种特性仅发生在凋亡细胞[7-10]。本实验研究显示，化疗组肿瘤部位摄取18F-ML-10，呈放射性分布浓聚区域，而对照组肿瘤部位未见明显摄取18F-ML-10。化疗组与对照组 SUVmax比较，差异有统计学意义（P=0.004）。流式细胞仪检测结果证实化疗组肿瘤细胞凋亡百分比明显增加，差异有统计学意义（P=0.004）。化疗组细胞凋亡百分比与瘤体组织SUVmax呈正相关（rs=0.943），表明18F-ML-10 PET/CT显像可用于细胞凋亡评估。

既往已有研究将18F-ML-10用于人体肿瘤放疗后的疗效评估，Allen等[13]利用18F-ML-10评价全脑放疗对脑肿瘤患者的疗效，结果显示肿瘤体积的变化和18F-ML-10在肿瘤部位浓聚的变化有良好的相关性。张晓军等[14]对6例脑转移瘤患者放疗后行18F-ML-10显像结果显示，其可用于颅脑转移瘤患者放疗后的凋亡评价。上述研究是关于颅脑肿瘤经放疗后，肿瘤组织的18F-ML-10摄取量与细胞凋亡具有一定的相关性。肿瘤组织经化疗后，利用18F-ML-10 PET/CT显像评价肿瘤细胞凋亡程度及疗效判定的相关研究较少，本实验是对其的一种尝试。实验样本量较少，而且研究对象非人体，因此还需进一步深入研究。随着研究的不断深入，18F-ML-10 PET/CT显像应用于评价肿瘤细胞凋亡将发挥更加重要的作用。