超声造影定量分析兔动脉粥样硬化病变

常小妮，沈亚梅，商静，邱英武，阮骊韬*

1.陕西省人民医院超声诊断中心，西安 710068；2.西安交通大学医学院第一附属医院超声科，西安 710061；

心脑血管疾病是威胁人类生命健康的主要因素，其病理基础是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）[1]。建立合适的动物模型模拟人类AS病变的发生、发展过程，是研究AS病因、病理机制及探讨其治疗措施的必要平台。本研究采用高脂高胆固醇饲料喂养大白兔的方法，建立AS动物模型。超声造影（CEUS）能够通过显示AS斑块内新生血管的分布情况用于评估斑块的稳定性[2]，CEUS定量分析方法较半定量分级方法对造影后斑块增强程度的评估客观、精确。然而，目前对动物模型AS内新生血管的影像研究较少，利用CEUS能否准确评估兔AS斑块内新生血管的变化尚无明确结论。本研究拟通过对AS模型兔行CEUS，采用定量分析的方法评价AS病变的血流灌注参数，分析AS发展过程中各个阶段及不同类型病变的新生血管情况。

1 材料与方法

1.1 建立 AS模型 选取雄性大白兔 22只，体重（2.45±0.22）kg。由西安交通大学动物实验中心提供[动物合格证号SCXK（陕）2008-008]。每日高脂高胆固醇饲料100 g/只（0.5%胆固醇、3%玉米油）。定期超声观测兔腹主动脉，发现内中膜增厚、斑块形成时行CEUS。

1.2 体重及血脂水平检测 分别于建模前、20周末、40周末称重，并于空腹状态下经耳中动脉采血3 ml，检测三酰甘油（triglycerid，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）。采用氧化酶法测定TG、TC，采用直接法测定LDL-C、HDL-C。

1.3 仪器 采用GE Logiq 9超声诊断仪，ML6-15探头，采用低机械指数反向编码造影成像技术（coded phased inversion，CPI）。

1.4 常规超声检查 分别于建模前、20周末和40周末观察兔动脉管壁内中膜厚度（intima-media thickness，IMT）的变化、AS斑块形成情况，记录并采集病变处数据及图像。在长轴切面测量 IMT及斑块厚度，多个斑块时选取厚度最厚的斑块。

1.5 CEUS检查 启用CPI的小器官造影模式，机械指数 0.13，聚焦于腹主动脉水平，静脉团注对比剂SonoVue（意大利Braccoon公司）1.5 ml。实时观察管腔及选定部位的显影情况2 min，并储存全过程动态图像。

1.6 图像分析及定量计算 启动声学密度定量分析的时间-强度曲线分析软件对感兴趣区（ROI）进行动态量化分析，观察对比剂微泡回声的量随时间的变化，获取ROI的CEUS增强相关参数。ROI大小为1 mm×1 mm ，将其手动放置于需检测部位，仪器拟合时间-强度曲线，软件自动计算并显示超声造影时间-强度曲线下面积（AUC）等相应测量参数。为了尽量减少人为误差，同一实验兔选择不同ROI重复测取3次，取平均值，以期获取尽可能准确的分析数据。AUC可较好地反映一定时间内局部组织造影增强的累积效应，与局部血流量呈线性正相关，若分布容积、剂量、增益条件控制恒定不变，AUC与实际流速及平均渡越时间成反比。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0软件，采用W检验法进行正态性检验。计量资料以±s表示，多组间体重、血脂指标、定量分析AUC值比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

按照造模过程的先后将实验兔分为 3个时间点进行观察，即建模前、20周末和40周末。由于造模周期较长，喂养过程中3个时间点分别存活22只、20只和17只。

2.1 体重的变化 随建模时间延长体重逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.01）。建模前与20周末和40周末比较，差异均有统计学意义（P均<0.01）；20周末与40周末比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2 血脂水平的变化 TG、TC、LDL-C值均随时间延长呈逐渐升高趋势，其中TG、LDL-C升高最为明显，HDL-C值随时间延长呈逐渐降低趋势，差异均有统计学意义（P均<0.01），不同时间点两两比较，差异均有统计学意义（P均<0.01）（表1）。

2.3 常规超声检查 建模前实验兔腹主动脉管壁光滑，内膜不易显示，内壁无增厚、隆起、斑块形成；20周末时，20只实验兔中，18只腹主动脉管壁局限性增厚（>1 mm），但无明显斑块形成；40周末时，17只实验兔腹主动脉内膜粗糙增厚，其中15只合并强回声粟粒样斑块形成。22只实验兔中，18只（81%）发生内中膜增厚，15只（68%）形成明显 AS斑块（图1）。

表1 不同时期实验兔体重及血脂水平比较（ ±s）

表1 不同时期实验兔体重及血脂水平比较（ ±s）

注：与建模前比较，*P<0.01；与20周末比较，#P<0.01

时间体重（k g）T C（m m o l/L）T G（m m o l/L）L D L-C（m m o l/L）H D L-C（m m o l/L）建模前（n=2 2）2.3 2±0.2 6 1.4 1±0.5 4#1.4 7±1.6 8#0.7 6±0.3 8#6.0 5±0.7 1#2 0周末（n=2 0）3.3 2±0.1 6*3 1.1 2±0.4 5*2.8 6±1.4 3*2 2.3 1±3.5 4*4.5 6±0.4 9*4 0周末（n=1 7）3.4 5±0.1 1*3 4.6 4±1.0 5*#5.8 8±1.1 4*#2 5.4 9±0.7 6*#0.5 0±1.6 9*#F值8 9.4 0 1 2 5.6 4 6 5.3 2 1 9 8.6 2 1 0 2.3 6 P值<0.0 1<0.0 1<0.0 1<0.0 1<0.0 1

图1 常规超声检查。建模前兔腹主动脉管壁光滑，内膜显示不清（A）；高脂饲料喂养20周末，内中膜局限性增厚（B）；40周末管壁可见明显斑块形成（C）

2.4 CEUS定量分析 团注对比剂后，实验兔腹主动脉时间-强度曲线大多呈单峰型，为陡直上升的增强期，和其后缓慢下降的清除期。建模前、20周末和40周末兔腹主动脉的 AUC 值分别为（516.63±23.74）%·s、（969.11±46.26）%·s和（1090.59±79.14）%·s，差异有统计学意义（P<0.01）；建模后20周末和40周末均高于建模前（P<0.01）；20周时与40周时比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

图2 模型兔在不同时间点AUC值比较。与建模前比较，△P<0.01；与20周末比较，▲P>0.05；与建模前比较，※P<0.01

3 讨论

建立动物模型研究AS病变的发生、发展和预防治疗，在目前的实验研究中应用广泛。本研究中经长期高脂高胆固醇饲料喂养实验兔，常规超声及CEUS定期观察，随着时间延长兔腹主动脉逐渐发生变化。首先，引起动脉内膜粗糙、IMT增厚。王家祥等[3]利用常规超声观察兔AS病变的研究结果显示，正常兔主动脉壁结构显示为“双线征”，即两条平行强回声线、中间为线状低回声带。但本研究显示常规超声不易清楚地显示正常兔腹主动脉壁内、中、外膜3层结构，尤其是内-中膜常规超声很难显示清楚，与徐丽荣[4]的实验研究结果一致，该实验也观察到常规超声无法区别动脉的内膜、中层及外膜，内膜显示不佳，其原因可能是由于兔动脉管壁薄，超声图像上呈现低回声的中膜层比较薄，故不易显示出动脉的内膜。随着高脂饲喂时间的延长，动脉AS病变逐渐发展，模型免腹主动脉内膜的回声较正常增强，常规超声也可清楚地显示内膜变粗糙、增厚直至粥样斑块形成，与徐丽荣[4]的研究结果一致。故超声检查可以较敏感地显示实验兔AS模型建立过程中动脉管壁的形态学变化，能够观察AS病变发展过程中不同阶段的表现。

单纯高脂高胆固醇饲料喂养法建立兔AS模型的优点是：实验对象易获得，操作简便、易行，且对动物损伤小，造模成功率高；此法符合AS形成机制的脂质浸润学说，较好地模拟了人类AS病变的形成过程。其缺点是：造模周期长，因动物个体差异的影响产生AS病变的时间不容易得到控制；所建立的AS模型其斑块性质不可控，尤其是建立破裂、出血等复杂性斑块更为困难。本研究所建立的AS兔模型，其斑块多为粟粒样强回声斑块。建模过程中，实验兔体重及血脂水平在不同时期的变化表明，体重及血脂水平与AS病变的发生、发展相关。

随着对AS病变的发病原因、发病机制及其引发心脑血管疾病原因的深入认识，评价AS斑块内的稳定性具有重要的临床意义。近年来，新型超声对比剂的应用和发展使得 CEUS可显示组织内微小血管的灌注情况，临床上已利用这一简便、无创的技术，通过检测斑块内的新生血管评估斑块的稳定性。用半定量的造影增强程度人为分级的方法，根据造影过程中斑块显影程度的不同可以反映斑块内新生血管的增生程度。Sun等[5]研究显示，应用CEUS增强程度人为分级的方法评价斑块内新生血管形成和斑块免疫组化微血管密度的检测结果具有相关性。但肉眼观察的方法主观性强，CEUS定量分析能对斑块的增强程度提供更加客观、量化的指标。定量分析较半定量分析可更客观地反映斑块造影增强情况[6]。

本研究中，模型兔腹主动脉在未形成明显斑块但已发生管壁增厚时，其内中膜AUC值较基础状态明显增高，提示AS早期尚未形成斑块时，病变局部增厚的内中膜内即已有明显的新生血管增生，并可通过CEUS敏感地检测到，与Magnoni等[7]的研究结果相符，该研究对25例有颈动脉斑块者与15例颈动脉正常者行 CEUS检查，分析其颈动脉外膜滋养血管（vasa vasorum，VV）造影增强的程度，并与自身 IMT相对照，结果表明有斑块组的VV明显高于正常组，而且与IMT相关。IMT是评价AS早期改变的重要指标，也是预测患者发生心脑血管意外危险性的有力指标[8-9]。既往研究显示，IMT与CEUS斑块增强程度之间无相关性[10-11]，提示IMT与新生血管增生程度之间不相关。结合分析既往研究与本研究，AS病变早期测量IMT与检测内-中膜新生血管情况是两个独立的评估指标，可以单独应用，也可以结合起来评估AS早期病变的危险性。

本研究中，兔腹主动脉形成明显斑块后，其CEUS定量分析AUC较内中膜增厚时略有增高，但差异无统计学意义，其可能原因为：本研究中模型兔所形成的斑块多为强回声斑块，斑块内新生血管较少，故与增厚内膜内的新生血管数量相比并无明显差异，而且本研究样本量偏小，有待今后增加样本量深入研究。