甜瓜离体雌核发育诱导单倍体研究进展

柯思佳 钱春桃 包卫红 倪维晨 李瑞霞

摘 要：自然界中自发的单倍体发生概率极低，通过人工的单倍体诱导技术能够大大提高单倍体发生概率。离体雌核发育诱导单倍体是植物单倍体育种的重要手段之一，重点综述了近年来通过离体雌核发育途径诱导甜瓜单倍体的研究进展，包括未授粉子房离体培养途径和辐射花粉诱导单倍体培养途径，分别讨论了供体基因型、培养基、接种时胚珠的发育时期、预处理方式等因素对诱导甜瓜单倍体再生频率的影响，同时对甜瓜单倍体培养中存在的问题进行了分析和讨论，并对甜瓜单倍体培养的前景进行了展望，以期为接下来甜瓜离体雌核发育诱导单倍体的研究工作提供参考。

关键词： 甜瓜； 雌核发育； 单倍体培养； 影响因素

Abstract： The natural spontaneous occurrences frequency of haploid is very low，but it can be significantly increased through artificial haploid induction techniques. In vitro gynogenesis is one of the most important approaches of plant haploid production. The paper reviewed the research progress on producing melon haploid by in vitro gynogenesis，including in vitro culture of unpollinated ovule and haploid induction via irradiated pollen. The effects of factors such as material genotype，medium，the stage of ovule development，pretreatment on haploid regeneration in melon were discussed. Meanwhile，the problems existing in melon haploid culture were analyzed，and the prospects of melon haploid culture were provided for in vitro gynogenesis in melon.

Key words： Melon； In vitro gynogenesis； Haploid culture； Influencing factors

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫芦科甜瓜属一年生草本植物，是栽培作物中变异类型最多的作物之一。我国是甜瓜栽培的次生起源中心之一，积累了丰富的甜瓜种质资源，现有1 132份，为甜瓜育种工作提供了充足的试材[1-2]。然而，由于常规育种中甜瓜自交系的选育周期长、工作量大，育种进程受到极大限制。如果我们能够缩短优良自交系的选育周期，就可以提高甜瓜杂种一代的育种速度[3]。自1922年Blakeslee[4]首次报道单倍体技术以来，植物遗传学家、植物生理学家、植物遗传育种学家等立即投入了对单倍体的研究。经试验证明，单倍体在植物遗传研究和育种实践中均具有重要的价值[5-7]。经过离体雌核诱导单倍体技术，再经染色体加倍能迅速获得纯合的双单倍体植株。利用这项技术，便可大大加速育种进度，获得新的育种材料，并且节省人工人力。因此，对于单倍体离体雌核发育途径的研究具有重要的意义。

1 未授粉子房离体培养

自San Noeum[8-9]首次在对大麦未授粉的子房培养中得到了单倍体植株以来，学者们开始在小麦[10]、玉米[11]以及西瓜[12]等不同作物上进行未授粉子房的离体培养，未授粉子房离体培养技术开始成为产生单倍体的一个重要途径。在葫芦科作物未授粉子房离体培养的研究中，已经在黄瓜[13]、甜瓜[3]、西瓜[12]等植物中获得了单倍体植株。一般通过未授粉子房离体培养，结果通常会产生单倍体（H）、双单倍体及多倍体与非整倍体植株，这几类植株无论是在植物遗传学研究还是在育种实践中都有很高的利用价值[14]。

在20世纪90年代，Gemesne等[15]及Ficcadenti等[16]率先对甜瓜未授粉子房离体培养技术进行摸索，并成功获得了甜瓜单倍体植株。21世纪以后，我国才开始了对甜瓜未授粉离体培养的研究。2004年，韩丽华[17]报道了通过甜瓜未授粉胚珠离体培养成功获得单倍体植株。随后王林[3]也开始了甜瓜未授粉胚珠离体培养的研究，但试验最终仅获得了丛生芽，分化的丛生芽倍性也有待进一步鉴定。2012年牛明明[18]以8个甜瓜杂交种为试验材料进行了离体雌核发育诱导单倍体的试验，但未能诱导出再生植株。

2 辐射花粉授粉诱导雌核发育

1987年，Sauton[19]等首次进行了甜瓜辐射花粉授粉诱导雌核发育的研究并成功获得了甜瓜单倍体植株。2002年，查丁石[20]在日本以X射线辐射花粉诱导雌核发育诱导形成了单倍体胚。随后，张永兵等[21]、孙玉宏等[22]、薛皓等[23]分别对甜瓜的基因型、培养基、辐射剂量、单倍体植株的加倍等方面进行了摸索，并对单倍体甜瓜的加倍进行了研究，为接下来我国研究者对甜瓜离体繁殖的研究打下了基础。

3 影响离体雌核发育途径的因素

3.1 基因型

经国内外许多学者研究发现，离体雌核发育诱导单倍体的成败及诱导率的高低与基因型有很重要的关系。不同基因型的材料其诱导率和出胚率有极显著差异，并且在同等诱导条件下，特定的基因型只对特定的培养基有反应[24]。Ficcadenti等[25]发现甜瓜不同的正反交组合对单倍体诱导率的影响差异显著。韩丽华[17]曾诱导了少数不同甜瓜品种未授粉胚珠，但只有厚皮甜瓜品系‘2B39诱导出单倍体植株。王林[3]发现甜瓜基因型除了影响离体培养的诱导效果之外，对其诱导途径也有影响。牛明明[18]以8个甜瓜杂交种为试验材料，发现不同基因型的甜瓜启动雌核发育的反应率明显不同。同样在甜瓜辐射花粉诱导雌核发育的试验中，基因型也是一个很关键的因素[26]。薛皓等[23]以48个甜瓜基因型为材料，结果有18个基因型没有诱导出再生植株。张永兵等[21]以5种甜瓜基因型为试材，结果只有其中2种获得了单倍体植株。牛明明[18]以2个杂交一代‘M1和‘M6为试验材料进行辐射花粉诱导单倍体试验，最终只有杂交种‘M1获得再生苗。由此可见，基因型对于雌核发育诱导单倍体技术有很重要的影响。所以我们在建立通过雌核发育诱导甜瓜单倍体的再生体系的时候，应该扩大对基因型的选择，并且针对每种基因型筛选出其特定的诱导条件，以提高单倍体的诱导率。

3.2 培养基组成

在未授粉子房离体培养试验中，培养基为外植体的生长发育提供了所需的营养物资，是人工诱导形态建成和离体雌核发育的重要影响因素。培养基对子房培养的影响是多方面的，包括对基本培养基类型的选择、外源激素种类及浓度等。这些因素之间相互影响，存在一定的交互作用，任何一个因素的改变都可能改变培养基的理化性质，从而改变试验效果。在实际工作中，不同的基因型都有其最适合的培养基，并且某些基因型只有在特定的培养基中才能被成功诱导，这给研究者们的工作增加了很多困难。

基本培养基对单倍体培养的影响很大，目前常见的基本培养基有MS、N6、CBM、White等，或在此基础上对某些成分略加改良。在葫芦科作物中，一般MS培养基相对比较适用。此外，外植体在培养过程中通常需要添加一些外源激素才能更好地诱导愈伤组织、胚状体的形成及芽、根的分化。韩丽华[17]用Zip、BA和IBA等激素成功诱导出了厚皮甜瓜的胚状体植株。Malik等[27]发现在甜瓜诱导培养基中添加0.04 mg·L-1和0.02 mg·L-1的TDZ能明显增加胚珠愈伤的产生，而0.6 mg·L-1的6-BA激素能明显增加外植体再生率。王林[3]在改良后的MS培养基上加入不同浓度的TDZ，结果发现，不同浓度TDZ预培养的胚珠膨大情况随着诱导培养基的不同而不同。牛明明[18]则发现启动雌核发育的最佳热激预处理培养基为：MS+0.04 mg·L-1 TDZ，最佳胚状体诱导培养基为MS+6 mg·L-1 2，4-D+2 mg·L-1 6-BA。通常培养基中也会添加少量附加成分，如AgNO3。Mohiuddin等[28]认为，AgNO3通过影响愈伤组织的内源激素代谢水平从而影响着葫芦科植物植株的再生。韩丽华[17]用不同浓度的AgNO3对甜瓜胚珠进行处理，发现用80 mg·L-1的AgNO3处理时出胚率最高，为0.74%。此外，除了添加外源激素外，培养基里还应该添加碳源，碳源不仅能给外植体提供能量，而且能维持一定的渗透压[29]。一般来说，蔗糖是最常用的碳源。有研究表明在葫芦科作物中，碳源浓度在20～40 g·L-1时诱导率较高，并且易于诱导形成单倍体植株[30]。在甜瓜的诱导中蔗糖浓度一般为30 g·L-1[3，17-18]。

在辐射花粉授粉进行胚拯救时，胚状体就已经形成，因此在试验中对基础培养基的要求没有未授粉子房、胚珠培养那么严格，一般选择E20A或MS培养基[18]。张永兵等[21]将长出绿色胚胎的种子，剥除种皮后转接到MS+0.2 mg·L-1 6-BA培養基上继续生长，最终诱导出2株单倍体再生植株。孙玉宏等[22]将长出绿色胚胎的种子剥取绿胚后，接种在MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培养基上生长，诱导29棵植株成苗，其中有11棵为单倍体植株。牛明明[18]和薛皓等[23]则通过试验发现在辐射花粉授粉进行胚拯救的基本培养基上即使不添加任何外源激素也可以诱导出单倍体植株。

3.3 接种时胚珠的发育时期

众多研究结果表明，接种时胚珠的发育时期对于未授粉子房离体培养试验中胚状体的诱导是一个很重要的因素。大量试验表明，接近成熟或成熟胚囊时期的子房或胚珠对于诱导雌核发育比较容易成功，而过于幼嫩的子房[31]或者大孢子时期[32]的子房诱导比较困难。韩丽华[17]、王林[3]等都认为对开花前14 h的甜瓜未授粉子房进行诱导，效果最好。牛明明[18]在开花前2 d、开花前1 d以及开花当天分别选取甜瓜未授粉子房进行诱导，结果发现，不同发育时期的子房诱导效果差异显著，开花前1 d的子房培养效果最好，开花前2 d的次之，开花当天的最差。

3.4 预处理

在接种前通常要对材料进行黑暗、变温等预处理，通过改变细胞的生理状态、分裂方式及发育途径，从而提高雌核发育的诱导率。在葫芦科作物中，一般对材料进行4 ℃的低温预处理。Metwally等[33]认为甜瓜在4 ℃低温下处理36 h诱导效果较好。Malik等[27]认为4 ℃低温培养4 d可以有效提高甜瓜出胚率。但是在我国，更多的是对甜瓜进行不同时间的热激处理。韩丽华[17]、王林[3]等认为甜瓜最佳培养条件为35 ℃暗培养4 d。牛明明[18]通过研究发现，30 ℃黑暗条件下热激3 d雌核发育的诱导率最高。

3.5 辐射源及辐射剂量

在辐射花粉授粉诱导单倍体试验中，辐射源及辐射剂量的选择是成功的关键。它受作物种类、植物生长期、辐射器官等多种因素的影响，适宜辐射剂量的选择是一个长期的过程，但研究者们已经摸索到一定的规律。实践中大多以临界剂量或半致死剂量作为适宜剂量的标准，在未到达临界致死剂量以前，单倍体的诱导频率随剂量的升高而增加。此外，辐射剂量与植物的倍性及花粉粒的大小也有关，倍性越高，花粉粒越小，越耐辐射。Faris等[34]认为Co60所产生的γ射线是葫芦科作物辐射花粉授粉诱导单倍体的有效辐射源。甜瓜的辐射剂量较常用的是500～2 500 Gy[19]。张永兵等[21]在300 Gy时成功诱导出了单倍体植株，而剂量为600 Gy时未能诱导供试材料形成单倍体。而牛明明[18]却得到了相反的结论。孙玉宏等[22]发现在300、500、750和1 000 Gy几个剂量中，以750 Gy剂量辐射处理的效果最好。薛皓等[23]则发现800 Gy的辐射剂量能使甜瓜的坐果率和再生植株的诱导率都达到相对较高的水平。所以在试验中在实际操作中，我们需要针对不同基因型的甜瓜做不同的辐射处理，从而确定适宜的辐射剂量，不能一概而论。除了Co60所产生的γ射线外，也有一些学者用X射线辐射花粉，如Yashiro等[35]利用X射线（67.08 C·kg-1）辐射花粉，在5个甜瓜基因型上成功诱导出单倍体胚。查丁石[20]也利用650 Gy的软X射线照射获得了甜瓜单倍体植株。

3.6 花粉辐射

据研究表明，植物生长过程中，适宜的温、湿度可以得到高单倍体发生率。针对葫芦科作物，通常在开花前1 d对雄花进行辐射处理后保存在低温（4 ℃）干燥条件下，第2天再给母株授粉。一般来说，高的辐射剂量可以提高胚的诱导率。但是在到达雌核发育临界致死剂量之前，低温贮存的时间越长，经高剂量辐射过的花粉活力丧失越快，而且可产生较高的花粉萌发率，这样反而会降低单倍体植株的发生率。所以在实际操作过程中，尽量在雄花进行辐射处理后立即授粉，从而提高单倍体的诱导率。而且在授粉过程中，每朵雌花需用3～4朵辐射过的雄花授粉，这样不仅可以增加花粉管到达胚囊的数量，而且可以更加有效地促进雌核发育[19，36]。

3.7 胚拯救

在辐射花粉诱导雌核发育过程中，种子中败育胚的比例很高，所以必须及时进行胚拯救。过早或过晚地进行胚拯救都会大大影响胚拯救的效果。Sauton[19，37]等通过试验发现甜瓜幼胚授粉后3周后在MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培养基上进行胚拯救，可以提高单倍体胚的诱导效率。薛皓[23]在授粉后3～4周采收果实进行胚拯救，诱导出正常发育的胚。张永兵等[21]和牛明明[18]在授粉4～5周进行胚拯救，结果都得到了单倍体植株。以上试验表明，甜瓜辐射授粉后3～5周做进行胚拯救，可以大大提高单倍体胚的诱导效率，此时多数胚为心形胚时可以获得高单倍体诱导率。但是孙玉宏等[22]通过试验发现，授粉后12 d为甜瓜胚拯救的最佳时间。这可能是因为特异的甜瓜基因型其胚败育的进程不一样，需要针对具体基因型具体分析。Custers等[38]通过研究发现，幼胚发育到心形胚阶段在适宜的培养基（E20A培养基含0.01 mg·L-1 IAA）上进行胚拯救，可以大大提高单倍体胚的诱导率。而且Kurtar等[39]通过倍性鉴定，仅有53.8%鱼雷形胚和23.1%的心形胚发育成单倍体，其余的则发育成双单倍体。

3.8 其他因素

除了上述因素，植物的生理状态及接种方式等因素都会对甜瓜离体雌核发育产生影响。

植物的生理状态受栽培的季节及所处的生长环境决定，对于离体雌核发育的诱导率和出胚率有一定的影响。赵晓菲[40]在对不同栽培季节的西葫芦子房进行诱导时发现，胚状体诱导率存在着极显著性差异，其中秋季最高，其次是夏季，春季最低。王林[3]发现，在相同的培养条件下春季的胚珠污染率明显高于秋季。然而韩丽华[17]在5月下旬进行甜瓜单倍体培养得到了单倍体植株，但是8月份同样的方法却未得到。

子房或胚珠不同的消毒方式和切割方式也影响着胚状体的诱导频率。陈玲[41]、闵子扬[42]等认为先切片再消毒比先消毒再切片更有利于未授粉子房进行离体雌核诱导。陈玲[41]和陈学军等[43]认为在子房横切、纵切、切啄、完整胚珠4种切割方式中，横切最有利于离体雌核发育的诱导。并且在培养基上，外植体的摆放也是有依据的，它会因为外植体的切分方式不同而不同，也会因为作物种类的不同而异。在黄瓜雌核发育诱导单倍体的试验中，Gemesne等[15]采用分离出胎座条平放在培养基上的方式进行接种，苏芃[44]则是切取1 mm厚的子房薄片平放在培养基上。孙松松[45]在对西葫芦未授粉子房离体培养的试验中，先去掉子房的外表皮，再切为1～1.5 mm的薄片平放在培养基上进行预培养。谢冰等[46]则是从未授粉的西葫芦子房中剥取完全的胚珠接种在培养基上，这种方式更有利于胚珠吸收营养，诱导效果更好，观察起来也更方便。韩丽华[17]在甜瓜未受精胚珠离体培养的研究中，通过比较剥胚珠法分离出胎座和横切为0.3～0.5 mm的薄片这2种接种方式后发现，经切片培养的胚珠，胎座组织对胚珠的生长有抑制作用，导致胚珠竞争不到营养，珠被发生愈伤化。

4 甜瓜单倍体培养存在的问题与未来研究的重点

虽然通过离体雌核发育途径获得甜瓜单倍体技术已经取得了一定的进展，但是在实际培养过程中还是存在着很多问题。胚状体的诱导率、成苗率很低，重复性差，至今未能建立起一套重现性好的培养体系，这些都严重影响着试验进程。而这主要是因为以下几点：一、基因型依赖性强。二、培养过程受多种因素相互影响。三、愈伤组织诱导率及分化率低。在今后的研究中，如何优化试验技术，提高诱导率从而建立稳定可重复的甜瓜单倍体培养体系依然是研究的重点。

目前在玉米单倍体育种中，报道了一个名为MATRILINEAL（MTL）的玉米花粉特异性磷脂酶基因[47-48]。据研究表明，该基因突变后能诱导玉米单倍体的形成，且在其他作物中具有保守性。随后，有研究发现水稻中的玉米MTL同源基因OSMATL经CRISPR-Cas9技術突变后可以诱导单倍体种子的形成[49]。所以在今后对甜瓜单倍体的研究中，应该在甜瓜中找到类似的同源基因来诱导甜瓜单倍体的形成，解决目前甜瓜单倍体育种中基因依赖性强的一大难题。

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