一种西瓜叶片DNA快速提取方法

周贤达 孙辉 丁康芬 王凤辰 王浩波

摘 要： 为了解决田间西瓜叶片提取DNA杂质较多及逐个样品提取效率低的问题，建立了基于96孔PCR扩增板，每次提取96个样，并调整提取液改善西瓜叶片DNA质量优化的方法，经超微量分光光度计检测，提取的DNA浓度为287～573 ng·?L-1，OD260/OD280在1.96左右，OD260/OD230为1.6～1.9，表明蛋白质、酚类及小分子杂质很少，DNA质量较高；普通引物聚丙烯凝胶电泳检测表明DNA质量稳定、扩增条带清晰。此方法与目前常用的植物基因组DNA提取方法相比具有通量高、速度快、成本低的优点，是适宜于种子企业西瓜分子标记检测相关工作的较好方法。

关键词： 西瓜； DNA提取； PCR

Abstract： In order to solve the problem of extracting more DNA impurities and low efficiency of single sample extraction in field watermelon leaves， a method based on 96-well PCR amplification plate to extract 96 samples at a time was established and the extract was adjusted to improve the DNA quality of watermelon leaves in this study. The concentration of DNA that extracted by spectrophotometer was 287-573 ng·μL-1， OD260/OD280 was around 1.96， and OD260/OD230 was 1.6-1.9， which indicated that there were few impurities in protein， phenols and small molecules， and the DNA quality was high. Polyacrylamide gel electrophoresis detection of common primers showed that the quality was stable and the amplified bands were clear. Compared with the commonly used plant genomic DNA extraction methods， this method had the advantages of high flux， high speed and low cost， it was a better method which was suitable for seed acid related molecular markers in seed enterprises.

Key words： Watermelon； DNA extraction； PCR

使用分子标记手段可以大幅减轻田间育种和质量检测的工作强度，提高工作效率。随着种子产业和分子生物学的不断发展，SSR等分子标记手段已越来越普遍地应用于种子室内纯度测定、品种真实性鉴定和分子标记辅助育种等环节中[1-2]。SSR分子检测的前提是高效提取符合质量要求的DNA，而不同来源的材料对提取的DNA质量有一定影响。正常的室内纯度检测所需DNA一般取材于发芽后的下胚轴或芽尖，DNA质量较高，但提取通量低、速度慢[3-6]。如果是对田间种植的西瓜品种进行纯度鉴定抽检，则只能用叶片提取；当开展分子标记辅助育种时，要保证有标记的单株正常在田间生长，由于室内发芽提取DNA损坏了单株，显然不适合采用该方法，也需要以田间生长的叶片作为提取DNA的材料，而西瓜叶片提取的DNA往往含有大量的酚类物质等杂质[5-7]，达不到后续试验的质量要求。另外，在实际商业化应用中，逐个样品提取DNA也不适应规模化应用分子标记检测。笔者的研究目的是在不影响DNA提取质量的前提下，尽可能将DNA提取过程与后期PCR扩增使用的96孔板配套起来，以提高工作效率；这种基于96孔PCR板的西瓜叶片DNA快速提取方法，在条件允许下也可以与移液工作站相配套，进一步提高自动化程度。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2018年7月19日从安徽省长丰县合肥丰乐种业西瓜试验基地的‘黑优美西瓜品种上取样，取样标准为西瓜蔓头部生长2～3 d的幼嫩叶片，共采集96个单株。样品使用1.5 mL离心管保存，取样后当天常温下送至合肥丰乐种业国家企业技术中心分子实验室，-20 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取

1.2.1 快速提取西瓜叶片DNA步骤 ①每片叶片取约0.5 cm×0.5 cm组织，按顺序放入96孔板中，每片叶片放1孔；②将装有叶片的96孔板底部浸泡在装有液氮的泡沫盒中2 min，期間使用3 mm十字螺丝将叶片研磨成干粉；③每样品孔加入提取液100 ?L（0.1 mol·L-1 Tris-HCL，pH 8.0；1.4 mol·L-1 NaCl；20 mmol·L-1 EDTA；2.5%（φ） SDS；1.5%（φ） PVP），迅速混匀，65 ℃水浴20 min，期间每10 min剧烈震荡1次；④每孔加入苯酚︰氯仿︰异戊醇为25︰24︰1的混合液100 ?L，颠倒混匀至液体颜色变成均匀绿色，5 000 r·min-1离心6 min；⑤将上清液转移至新96孔板，每孔加入冰冻无水乙醇100 ?L，轻轻倒置混匀，-20 ℃静置10 min；5 000 r·min-1离心2 min，弃上清液；⑥用70%乙醇洗涤2次，室温下倒置，干燥沉淀；加入50 ?L TE溶解沉淀，5 000 r·min-1离心3 min，取上清液，4 ℃保存备用[6-15]。

1.2.2 CTAB法西瓜叶片DNA提取步骤 参考《精编分子生物学实验指南》中提供的方法[3]。

1.3 DNA浓度及纯度测定

使用Nano Drop 2000C（ThermoFisherScientific Inc.）测定OD230、OD260、OD280及DNA浓度。

1.4 SSR分子标记检测

1.4.1 供试SSR引物 选用《西瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法》（NY/T 2472—2013）[16]中推荐的BVWS01734、BVWS00358两对引物，由安徽通用生物技术公司合成。

1.4.2 SSR扩增 参照周贤达等[12]的反应体系，具体如下：10×PCR Buffer（含Mg2+）1 μL；2 mmol·μL-1 dNTP 0.9 μL；5 U·μL-1 Taq DNA聚合酶 0.1 μL；10 μmol·μL-1正向引物0.25 μL；10 μmol·μL-1负向引物0.25 μL；20 ng·μL-1模板DNA 2 μL；用ddH2O补齐至总体积10 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 sec，55 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保温。

1.4.3 PCR扩增产物检测 使用4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物：每10 μL PCR反应产物加入2 μL 1×溴酚蓝上样缓冲液，稳压100 W电泳20 min，电泳结束后用硝酸银染色观察电泳条带，拍照并记录结果。

2 結果与分析

2.1 DNA提取时间比较

由DNA提取时间来看，使用西瓜叶片DNA快速提取法完成96个西瓜叶片的DNA提取每人共用时4 h，而使用CTAB法完成相同规模DNA提取则每人需要20 h [6]。

2.2 DNA质量检测

从表1可以看到，西瓜叶片DNA快速提取法提取的DNA浓度在287～573 ng·?L-1，相比CTAB法提取的DNA浓度是明显低一些；OD260/OD280值在1.96左右，与CTAB的值2.0左右接近，说明提取的DNA中的RNA含量小，基本没有蛋白质和酚污染；OD260/OD230值约1.6～1.9，与CTAB法提取的比值1.8～2.0也接近，说明小分子污染很轻，不会对后续PCR扩增产生不利影响；DNA产率在7.18～14.34 ng·mg-1，虽然明显低于CTAB法的产率，但完全可以满足室内西瓜种子测纯及后续分子试验的要求。

2.3 SSR扩增检测

从图1和图2对比可以发现，全部48个单株的带型在2种DNA提取方法扩增的BVWS01734引物扩增的带型除无扩增单株外完全一致，西瓜叶片DNA快速提取法扩增的结果相比CTAB法提取的条带亮度稍显暗淡，但主要带型表现无差异。图3和图4对比可以发现，全部48个单株在BVWS00358引物扩增带型完全一致，2者条带亮度也无明显区别。

在与CTAB法提取的西瓜全基因组DNA扩增结果的比较中可以发现，2种方法之间在扩增片段大小和非特异性扩增上无区别，西瓜叶片DNA快速提取法完全可以满足田间采集的西瓜叶片进行常规PCR扩增的需求。

3 讨 论

针对田间采集的西瓜叶片中酚类物质极高，在叶片转运、保存过程中易由于细胞破裂导致酚类物质污染，进而导致后期DNA褐化而抑制PCR扩增的情况，笔者使用PVP-40结合酚类物质，后期经离心去除；试验结果表明，该方法提取的西瓜基因组DNA质量与浓度均较高，可以满足后续试验要求，且与CTAB法相比，因为PVP-40的加入，可以有效避免西瓜叶片在采集、转运过程中因机械力作用导致细胞破碎进而产生的酚类物质污染问题，明显提高成熟西瓜叶片的DNA提取质量[6-7，14]。

笔者充分利用96孔PCR板的通量高、普及化程度高的特点，将DNA提取与后续PCR扩增步骤同步对应，相较传统方法可以节省3/4的时间，从而大大提高了整体检测效率；而且由于整体过程在标准96孔PCR扩增板内进行，也方便后期通过综合运用96孔组织匀浆机、自动移液工作站继续提高效率、扩大规模，从而满足种业公司西瓜室内大规模检测工作的要求。

从电泳图中可以看到，使用西瓜叶片DNA快速提取方法提取的西瓜全基因组DNA扩增产物还是存在扩增量较低的情况（图1），在特殊情况下会出现扩增失败的情况，如图1中的6号、8号10号及23号单株，这种情况的出现一方面与西瓜品种本身有一定关系，另一方面也与引物的扩增能力有关，需要进一步探讨、研究。

在试验进行过程中发现，提取时样品研磨时间对提取效果有较大影响，操作人员的熟练程度直接决定了样品研磨时间，并最终对提取质量和DNA产率产生影响，因此熟练操作至关重要。

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